Hausgemachte Mutagenese von Whole Plasmide

Summary

Seite Mutagenese ganzer Plasmide ist ein einfacher Weg, um etwas anders Variationen eines Original-Plasmid zu erzeugen. Hier zeigen wir eine einfache und kostengünstige Möglichkeit, Basensubstitutionen in ein Plasmid mit Standard-Reagenzien einzuführen.

Abstract

Seite Mutagenese ganzer Plasmide ist ein einfacher Weg, um etwas anders Variationen eines Original-Plasmid zu erzeugen. Mit dieser Methode wird die geklonte Zielgen kann durch Substitution, Deletion oder Insertion von wenigen Basen direkt in ein Plasmid verändert werden. Es funktioniert einfach durch die Verstärkung der gesamten Plasmid, in einem nicht PCR-basierte Thermocycling Reaktion. Während der Reaktion mutagene Primer, die das gewünschte Mutation in die neu synthetisierte Plasmid integriert. In diesem Video-Tutorial zeigen wir eine einfache und kostengünstige Möglichkeit, Basensubstitutionen in ein Plasmid einzuführen. Das Protokoll arbeitet mit Standard-Reagenzien und ist unabhängig von kommerziellen Kits, die oft sehr teuer. Anwendung dieses Protokolls können die Gesamtkosten einer Reaktion auf ein Achtel von dem, was es kostet mit einigen der kommerziellen Kits reduzieren. In diesem Video, das wir auch auf kritischen Schritte Kommentar während des Prozesses und geben detaillierte Anweisungen, wie die mutagene Primer-Design.

Protocol

Das Prinzip der Methode:

Die Mutagenese des gesamten Plasmide erklärt in diesem Video ist eine Mutagenese-Methode, die Sie zu einem geklonten Zielgen durch Substitution, Deletion oder Insertion von wenigen Basen direkt in ein Plasmid ändern können. Es funktioniert durch die Verstärkung der gesamten Plasmid, in einem nicht PCR-basierte Thermocycling Reaktion. Während der Reaktion mutagene Primer, die die gewünschten Mutation in Form von Fehlanpassungen der ursprünglichen Plasmid, werden in die neu synthetisierte Plasmid integriert. Nach dem Entfernen des ursprünglichen Plasmid aus der Reaktion des mutierten Plasmid wird in E. verwandelt coli. Die folgenden Schritte sind für Screening-Zwecke nur, weil die Mutation Effizienz dieser Methode ist nicht 100%. Die ganze Prozedur dauert drei Tage, aber der größte Teil innerhalb eines Tages durchgeführt werden.

1,0 Tag eins:

1,1 Thermocycling Reaktion:

Original-Plasmid: Diese Mutagenese-Protokoll funktioniert am besten mit Plasmiden bis zu 10kb. Größere Plasmide sind ein bisschen schwierig, mit dieser Methode mutieren und etwas Geduld und Anpassung der Thermocycling Bedingungen und / oder der zuständigen Zellen. Außerdem das Plasmid, das Sie mit muss von einem Damm + Bakterienstamm isoliert werden. Für die Thermocycling Reaktion, die Sie benötigen 10 bis 60 ngs des Plasmids Sie mutieren.

Grundierungen: Bevor Sie einrichten können Ihre Thermocycling Reaktion müssen Sie Ihre Primer zur Hand haben. Sie benötigen etwa 150 ng eines jeden mutagene Primer. Es ist ok, wenn man 1,5 ul einer 1:10 verdünnten 100 pM Bilanz zu ziehen. Es gibt ein paar einfache Richtlinien, die Sie bei der Gestaltung Ihrer mutagene Primer muss:

• Die Primer sollten komplementär zueinander
• Die Primer sollten zwischen 25 und 45 Nukleotide lang sein
• Die Mutationen in Form von Fehlanpassungen der ursprünglichen Plasmid muss in beide Primer enthalten sein
• Das Missverhältnis sollte in der Grundierung zentriert und flankiert von mindestens 8 Nukleotiden auf jeder Seite
• Die Primer sollten eine GC-Gehalt von mindestens 40%
• Die Primer sollten 5 prime und 3 prime mit einem oder mehreren Gs oder Cs Ende
• Die Primer müssen nicht phosphoryliert werden, noch müssen sie FPLC oder PAGE gereinigt, lediglich entsalzt sie sein sollten.
• Für die Berechnung der Tm Sie brauchen keine Formel, sondern Tm auf den Versand-Zertifikat sollte höher sein als 60 ° C.
• Für Screening-Zwecke ist es praktisch, einfügen oder löschen Restriktionsstelle mit Ihrem Mutation. Aufgrund der Degeneration des genetischen Codes gibt es viele Möglichkeiten, um eine Restriktionsschnittstelle mit Ihrem gewünschten Mutation einfügen. Die Website des New England Biolabs bietet ein Werkzeug, um eine solche geeignete Restriktionsschnittstelle zu finden. Geben Sie einfach Ihre Primer-Sequenz kodierend für die Aminosäuresequenz Sie es wünschen, mit der Mehrdeutigkeit Code für DNA. Das Enzym-Finder-Tool wird Ihnen sagen, welche Restriktionsstellen parallel zu Ihrem gewünschten Mutation eingeführt werden. Wenn Sie nicht finden können, eine mögliche oder praktische Restriktionsstelle durch diese Weise können Sie neue Restriktionsschnittstelle ohne Bezug auf den genetischen Code an der Stelle der Mutation einfügen. Danach können Sie mit diesem Plasmid als Template für eine Reihe von Mutationen in dem dieser Restriktionsstelle durch Einfügung des neuen mutagene Primer gelöscht werden. Dieser Ansatz kann sehr praktisch, wenn Sie planen, eine Reihe von Mutationen an der gleichen Stelle des Plasmids zu tun haben.

DNA-Polymerase: Für dieses Verfahren benötigen Sie eine thermostabile DNA-Polymerase, die 3'-5 'Exonuklease-Aktivität aufweist und schafft stumpfen Enden. Wir verwenden immer rekombinante Pfu-Polymerase von Fermentas. Wenn Sie Probleme mit der Verstärkung Schritte haben Sie vielleicht versuchen, eine höhere Qualität Polymerase, aber für die meisten Zwecke der Standard Pfu genug sein. Vervollständigen Sie die Reaktion mit dNTPs, Polymerase-Puffer und Wasser.

1,2 Thermocycling Bedingungen

Die Thermocycler sollte in folgender Weise eingestellt werden. Die erste und wiederkehrende Denaturierung Phase ist es, 30sec bei 95 ° C eingestellt

Die Annealingtemperatur der Primer darf nicht mit komplizierten Formeln berechnet werden. Wir in der Regel legen Sie die Annealingtemperatur auf 55 ° C und die Glühzeit zu einer Minute. Für Primer 25 bis 30 Nukleotiden, die Sie verwenden werden meistens funktioniert dies für uns 95% der Zeit. Jedenfalls, wenn dies nicht funktionieren sollte, versuchen Sie einfach die Variation der Annealing-Temperatur zwischen 50 - und 60 ° C.

Die Dehnung ist abhängig von der Polymerase die Sie benutzen. In dieser Demonstration verwenden wir die Pfu-Polymerase von Fermentas, die für eine Dehnung Temperatur von 72 ° C nennt Die Dehnung der Zeit variiert je nach Größe des Plasmids. Wir sind immer zu berechnen 1 min pro kb, und fügen Sie eine zusätzliche Minute an, dassZeit. Zum Beispiel für eine 9kb Plasmid wir wählen würden 10min als Dehnung der Zeit.

18 Zyklen ausreichend sind, um zu schaffen genug mutierte Plasmid für die weitere Verwendung. Keeping die Anzahl der Zyklen gering ist, spart auch Zeit.

1,3 Gelcheck nach thermischer Reaktion

Die erfolgreiche Amplifikation sollte mittels einer Elektrophorese überprüft werden. Direkt nach dem Radfahren beendet ist, laden 5 ul der Reaktion auf ein 1% TAE-Agarosegel. Wenn die Verstärkung erfolgreich war, sollten Sie eine deutliche Bande. Allerdings, wenn das neu synthetisierte DNA ist nicht deutlich sichtbar auf dem Gel, können Sie versuchen, Niederschlag der ganzen Reaktion und verwenden es für die Transformation in den nächsten Schritt. Für uns hat nur selten gearbeitet, aber es lohnt sich zu versuchen. Das Beste, was zu tun ist, wenn die Reaktion nicht funktioniert ist die Glühtemperatur anzupassen.

1,4 DpnI Verdauung:

Vor Transformation der ursprünglichen Plasmid, das als Vorlage diente müssen aus der Reaktion auf starken Hintergrund zu verhindern entfernt werden. Dies wird durch Restriktionsverdau mit DpnI getan. Diese Restriktionsendonuklease schneidet nur methylierte Plasmid. Seine Anerkennung und Restriktionsstelle wird die Sequenz GATC, während A hat methyliert werden. Wenn Verdau mit DpnI nur das Original nicht mutierten Plasmid, das von einem Damm isoliert + Stamm geschnitten wird, ist das neu synthetisierte mutierte Plasmid, das nicht methylierte nicht durch DpnI betroffen. Einfach geben Sie 1-2 pl DpnI, um die Reaktion und inkubieren sie mindestens eine Stunde bei 37 °. Bei Verwendung des Schnell verdauen DpnI die Inkubationszeit kann bis etwa 15 Minuten verringert werden. Die Qualität Ihrer DpnI und die Inkubationszeit dieser Restriktionsverdau stark bestimmt, wie stark Ihr Hintergrund mit mutierten Plasmid wird.

1,5 Transformation:

Nach DpnI Verdauung des Plasmids ist bereit für die Umwandlung in die zuständige E. coli-Zellen. Fügen Sie einfach 5 pl vom DpnI Abbaureaktion in die kompetenten Zellen und die Transformation wie in Ihrem Labor empfohlen. In unserem Fall verwenden wir das Hitzeschock-Verfahren durch Inkubation der Bakterien-Plasmid-Mischung auf Eis für 30 min und dann Hitzeschock es bei 42 ° C für 90 sek. Nach Zugabe von 200 ul SOC-Lösung werden die Bakterien inkubiert, kräftiges Schütteln bei 37 ° C für 1 h. Nach 1 Stunde werden die Bakterien auf die Auswahl-Agar ausplattiert.

2,0 Tag zwei

2.1 Abschirmung der Klone Teil 1: Auswahl der Klone

Da die Mutation Effizienz ist nicht 100% Sie brauchen, um für Ihre Mutanten Bildschirm. Wir tun dies durch Restriktionsverdau, in denen wir prüfen für An-oder Abwesenheit der Restriktionsschnittstelle, die wir hinzugefügt oder gelöscht durch Primer-Integration. Zu diesem Zweck haben wir in der Regel abholen acht Kolonien und wachsen sie über Nacht für Plasmid-Präparation auf den nächsten Tag.

3,0 Tag drei

3,1 Screening der Klone Teil 2: Restriktionsverdau mit Markerenzym

Am dritten Tag Sie eine Mini Prep und anschließende Restriktionsverdau mit Ihrem Markerenzym. Auf dem Gel können Sie dann sehen, welche Ihrer Klone tragen die gewünschte Mutation und welche nicht.

Das Screening-Verfahren mit Restriktionsverdau funktioniert sehr gut. Dennoch sollten Sie Ihre erfolgreiche Mutation durch Sequenzierung bestätigt.

Discussion

Seite Mutagenese ist eine Mutagenese-Verfahren, das eine schnelle Möglichkeit, ein Gen von einem Plasmid durchgeführt mutieren zur Verfügung stellt. Die gesamte Reaktion kann in nur einem Tag durchgeführt werden. Mit dieser Methode wird es brauchen nur ein Paar kostenlose Primer, die die gewünschten Mutationen und das Korrekturlesen Polymerase wie Pfu-Polymerase. Die neu synthetisierte Plasmid kann von den Eltern Plasmid durch Verdauen der Reaktion mit dem Restriktionsenzym DpnI getrennt werden. Dieses Enzym verdaut nur die methylierte DNA. Deshalb nur die neu synthetisierte Plasmid transformiert werden kann. In diesem Tutorial haben wir gezeigt, Durchführung einer Mutagenese mit einem hausgemachten Mutagenese-Kit. Der Vorteil dieses Kits ist die Kostenersparnis, während die Wirksamkeit bleibt. Die kritischen Punkte dieser Methode sind die Primer-Design und der Glühtemperatur. Bei den neu synthetisierten DNA kann nicht visualisiert werden nach der Elektrophorese, die kann das Scheitern der Methode zeigen, kann man versuchen, Niederschlag der ganzen Reaktion und verwenden es für die Transformation in Bakterien. Doch der beste Weg, um dieses Problem zu lösen versucht, die Annealingtemperatur zu optimieren oder erhöhen Sie die Länge der konstanten Region in den Primern. Ferner kann mit einem hochwertigen Polymerase oder Restriktionsenzym verbessern auch die Empfindlichkeit der Reaktion. Die kompetenten Zellen sind auch ein wichtiger Faktor, der Erfolg der Methode Effekte. Deshalb Mitte (107 KBE / ug DNA) oder stark (109 KBE / ug DNA) kompetente Zellen sind zu bevorzugen.

Obwohl in diesem Tutorial werden wir nicht zeigen, das Löschen oder Einfügen, indem Sie die hausgemachten Kit, waren wir erfolgreich, diese in unserem Labor zu tun. Wir konnten erfolgreich ersetzen, einfügen oder löschen Sie mindestens 3 Basen zur gleichen Zeit.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pfu polymerase (recombinant or native)	Fermentas	EP0571 or EP0501
dNTP mix 10 mM	Fermentas	R0191
DpnI or DpnI Fast digest	Fermentas	ER1701
primers	Invitrogen		desalted