Homemade Site Riktad mutagenes av Whole Plasmids

Summary

Site riktad mutagenes av hela plasmider är ett enkelt sätt att skapa lite olika varianter av ett original plasmid. Här visar vi ett enkelt och kostnadseffektivt sätt att introducera basera ersättningar till en plasmid med vanliga reagenser.

Abstract

Site riktad mutagenes av hela plasmider är ett enkelt sätt att skapa lite olika varianter av ett original plasmid. Med denna metod klonade målgenen kan ändras genom substitution, radering eller införande av ett fåtal baser direkt i en plasmid. Det fungerar genom att helt enkelt förstärka det hela plasmiden, i en icke PCR-baserad termocykling reaktion. Under reaktionen mutagena grundfärger, bär den önskade mutation, är integrerade i den nyligen syntetiserade plasmiden. I denna video tutorial visar vi ett enkelt och kostnadseffektivt sätt att introducera bas substitutioner i en plasmid. Protokollet fungerar med standardreagens och är oberoende från kommersiella kit, som ofta är mycket dyra. Tillämpningen av detta protokoll kan minska den totala kostnaden för en reaktion på en åttondel av vad det kostar att använda några av de kommersiella kit. I den här videon kommenterar vi också kritiska steg under processen och ge detaljerade instruktioner om hur man konstruerar den mutagena grundfärger.

Protocol

Principen om Metod:

Webbplatsen riktad mutagenes av hela plasmider förklaras i den här videon är en mutagenes metod som tillåter dig att ändra ett klonat målgenen genom substitution, radering eller införande av ett fåtal baser direkt i en plasmid. Det fungerar genom att förstärka det hela plasmiden, i en icke PCR-baserad termocykling reaktion. Under reaktionen mutagena grundfärger, bär den önskade mutation i form av obalans till den ursprungliga plasmiden, är integrerade i den nyligen syntetiserade plasmiden. Efter avlägsnande av den ursprungliga plasmid från reaktionen den muterade plasmiden får omvandlas till E. coli. Följande steg är för screening avsikterna bara, eftersom mutationen effektiviteten i denna metod är inte 100%. Hela proceduren tar tre dagar, men största delen kan ske inom ett dygn.

1,0 Dag ett:

1,1 termocykling reaktion:

Original Plasmid: Denna webbplats riktad mutagenes-protokollet fungerar bäst med plasmider upp till 10kb. Större plasmider lite svårt att mutera med denna metod och kan ta lite tålamod och justering av termocykling villkor och / eller behöriga celler. Dessutom plasmiden som du arbetar med måste isoleras från en damm + bakterietyp. För termocykling reaktion du kommer att behöva 10 till 60 NGS av plasmiden du vill att mutera.

Grundfärger: Innan du kan ställa in din termocykling reaktion måste du ha din grundfärger till hands. Du behöver ungefär 150 ng av varje mutagena primer. Det är ok om du tar 1,5 l av en 1:10 utspädd 100 pm lager. Det finns några enkla riktlinjer du måste tänka på när du utformar din mutagena grundfärger:

• Primers bör komplettera varandra
• Primers bör vara mellan 25 och 45 nukleotider i längd
• De mutationer i form av obalans i den ursprungliga plasmiden måste ingå i både primer
• Den obalans bör vara centrerad i primer och flankeras av minst 8 nukleotider på varje sida
• Primers bör ha en GC-innehåll på minst 40%
• Primers ska sluta 5 främsta och 3 prime med en eller flera GS eller Cs
• Primers behöver inte vara fosforyleras, inte heller måste FPLC eller PAGE renas, bara desalted de borde vara.
• För beräkning av Tm behöver du inte någon formel utan TM på sjöfarten certifikatet ska vara högre än 60 ° C.
• Vid screening är det praktiskt att sätta in eller ta bort en begränsning webbplats med mutation. På grund av den degeneration av den genetiska koden finns det många möjligheter att sätta en begränsning webbplats med önskad mutation. Webbplatsen för New England Biolabs tillhandahåller ett verktyg för att hitta en så lämplig begränsning plats. Fyll bara i din primer sekvens som kodar för aminosyrasekvens du önskar, med hjälp av tvetydighet kod för DNA. Enzymet hitta verktyget berätta vilka begränsningar webbplatser kan införas parallellt med önskad mutation. Om du inte kan hitta några möjliga eller praktiska restriktioner webbplats genom detta sätt kan du infoga några nya restriktioner webbplats utan om den genetiska koden på platsen för mutationen. Därefter kan du använda denna plasmid som mall för en rad mutationer i vilken denna begränsning webbplats kommer att raderas av införandet av den nya mutagena grundfärger. Detta tillvägagångssätt kan vara mycket bekvämt om du planerar att göra en serie mutationer på samma plats i plasmiden.

DNA-polymeras: För denna metod behöver du en termostabila DNA-polymeras som uppvisar 3'-5 'exonuclease aktivitet och skapar trubbiga ändar. Vi använder alltid rekombinant Pfu-polymeras från Fermentas. Om du har problem med förstärkning åtgärder du kan prova en högre kvalitet polymeras, men för de flesta ändamål standarden Pfu kommer att räcka. Fyll i reaktion med dNTPs, polymeras buffert och vatten.

1,2 termocykling villkor

Den termocykler bör inrättas på följande sätt. Den inledande och återkommande denaturering fas är satt till 30 sekunder vid 95 ° C.

Den glödgning temperatur primers får inte beräknas med komplicerade formler. Vi sätter oftast glödgning temperaturen till 55 ° C och glödgning tiden till en minut. För grundfärger på 25 till 30 nukleotider som du kommer att använda det mesta fungerar detta för oss 95% av tiden. Hur som helst, om detta inte skulle fungera, helt enkelt försöka variera annealing temperatur mellan 50 - och 60 ° C.

Förlängningen temperatur beror på polymeras du använder. I den här demonstrationen använder vi Pfu-polymeras från Fermentas, vilket kräver en förlängning temperatur på 72 ° C. Förlängningen varierar beroende på storleken på plasmiden. Vi beräknar alltid 1 min per kb, och lägga till en extra minut för attgången. Till exempel för en 9KB plasmid vi skulle välja 10min som töjning tid.

18 cykler är tillräckliga för att skapa tillräckligt med muterade plasmid för vidare användning. Att hålla antalet cykler låg, också sparar tid.

1,3 Gelcheck efter termocykling reaktion

Den framgångsrika förstärkningen bör kontrolleras genom att utföra en elektrofores. Direkt efter cykling är klar belastning 5 ìl av reaktionen på en 1% TAE agarosgel. Om förstärkningen lyckades, bör du se en distinkt band. Men om den nyligen syntetiserade DNA är inte klart synlig på gelen, kan du försöka att fälla hela reaktionen och använda den för omvandling i nästa steg. För oss har sällan fungerat, men det är värt att ge ett försök. Det bästa du kan göra om reaktionen inte fungerar är att anpassa glödgning temperaturen.

1,4 DpnI matsmältning:

Innan omvandling ursprungliga plasmiden som tjänade som en mall måste tas bort från en reaktion för att undvika starkt bakgrund. Detta sker genom att begränsningen uppslutning med DpnI. Denna begränsning endonuclease skär bara denaturerad plasmid. Erkännande och begränsning plats är sekvensen GATC medan A måste vara denaturerad. När smälta med DpnI endast den ursprungliga unmutated plasmiden som var isolerad från en damm + blir stammen skuren, den nyligen syntetiserade muterade plasmid som inte är denaturerad påverkas inte av DpnI. Lägg bara till 1-2 ìl av DpnI till reaktionen och inkubera det minst en timme vid 37 °. När du använder Snabb smälta DpnI inkubationstiden kan minskas till ca 15 minuter. Kvaliteten på din DpnI och inkubationstiden för denna begränsning matsmältning avgör mycket hur stark din bakgrund med unmutated plasmid kommer att bli.

1,5 Transformation:

Efter DpnI matsmältning plasmiden är redo för omvandling till de behöriga E. coli celler. Lägg bara till 5 l från DpnI matsmältningen reaktionen i den behöriga celler och utföra omvandlingen som rekommenderas i ditt lab. I vårt fall använder vi proceduren värmechock genom inkubering av bakterier plasmiden blandningen på is i 30 min och sedan heat shock den vid 42 ° C i 90 sekunder. Efter att ha lagt 200 l SOC-lösning, är att bakterierna odlas, kraftigt skakande, vid 37 ° C under 1 h. Efter 1 timme bakterierna är pläterade på att välja agar medier.

2,0 Dag två

2,1 Screening av kloner Del 1: Val av kloner

Eftersom mutationen effektiviteten är inte 100% du måste skärm för mutanter. Vi gör detta genom begränsning matsmältning där vi kontrollera om närvaro eller frånvaro av begränsningen plats som vi lagt till eller tagit bort via primer integration. För detta ändamål har vi brukar plocka upp åtta kolonier och växa dem över natten för plasmid preparatet på nästa dag.

3,0 Dag tre

3,1 Screening av kloner del 2: Restriction uppslutning med markör enzym

På tredje dagen du gör en Mini Prep och efterföljande begränsning matsmältning med din markör enzym. På gelen kan du sedan se vilken av dina kloner bär önskad mutation och vilka som inte.

Den screeningmetod med begränsning matsmältningen fungerar mycket bra. Trots detta ska bekräfta lyckad mutation av sekvensering.

Discussion

Site riktad mutagenes är en mutagenes-metod som ger ett snabbt sätt att mutera en gen som bärs av en plasmid. Hela reaktionen kan ske på endast en dag. Med denna metod måste den bara ett par gratis primer bär den önskade mutationer och en korrekturläsning polymeras som Pfu-polymeras. Den nyligen syntetiserade plasmid kan separeras från föräldrarna plasmid genom uppslutning av reaktionen med begränsningen enzymet DpnI. Detta enzym smälter bara metylerat DNA. Därför har endast den nyligen syntetiserade plasmiden kan transformeras. I denna tutorial har vi visat att utföra en webbplats riktad mutagenes genom att använda en hemmagjord mutagenes kit. Fördelen med detta kit är kostnadsbesparande medan effektivitet kvarstår. De kritiska punkterna i denna metod är primer design och glödgning temperatur. Vid den nyligen syntetiserade DNA inte kan visualiseras efter elektrofores, vilket kan ange fel i metoden, kan man försöka att fälla hela reaktionen och använda den för omvandling i bakterier. Men det bästa sättet att lösa detta problem är att försöka optimera glödgning temperaturen eller öka längden på den konstanta regionen i grundfärger. Vidare kan använda en hög kvalitet polymeras eller restriktionsenzymanalys också förbättra känsligheten för reaktionen. Den behöriga cellerna är också en viktig faktor som effekter resultaten från utvärderingen denna metod. Därför mitten (107 cfu / mikrogram DNA) eller mycket (109 cfu / mikrogram DNA) behöriga celler är att föredra.

Även i denna tutorial vi inte visa borttagning eller insättning genom att använda hemgjord kit var vi framgångsrika att göra dessa i vårt laboratorium. Vi lyckades att ersätta, infoga eller ta bort minst 3 baser samtidigt.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pfu polymerase (recombinant or native)	Fermentas	EP0571 or EP0501
dNTP mix 10 mM	Fermentas	R0191
DpnI or DpnI Fast digest	Fermentas	ER1701
primers	Invitrogen		desalted