Mutagenesis האתר ביתי בימוי של פלסמידים שלמים

Summary

Mutagenesis האתר בבימויו של פלסמידים כולה היא דרך פשוטה ליצור וריאציות שונות במקצת של הפלסמיד המקורי. כאן אנו מדגימים דרך יעילה קל עלות להציג החלפות בסיס לתוך ריאגנטים באמצעות פלסמיד רגיל.

Abstract

Mutagenesis האתר בבימויו של פלסמידים כולה היא דרך פשוטה ליצור וריאציות שונות במקצת של הפלסמיד המקורי. באמצעות שיטה זו הגן היעד משובטים ניתן לשנות על ידי מחיקה החלפה, או החדרה של כמה בסיסים ישירות לתוך פלסמיד. זה עובד פשוט על ידי הגברה פלסמיד שלם, בתגובה PCR מבוססי הלא thermocycling. במהלך התגובה primers מוטגניות, נושאים את המוטציה הרצויה, משולבים פלסמיד מסונתז החדש. זה וידאו של מורה לנו להראות דרך יעילה קל עלות להציג החלפות בסיס לתוך פלסמיד. פרוטוקול עובדת עם חומרים כימיים סטנדרטיים אינה תלויה ערכות מסחריות, אשר לעתים קרובות הן יקרות מאוד. יישום פרוטוקול זה יכול להפחית את העלות הכוללת של כתגובה שמינית ממה שזה עולה באמצעות כמה ערכות מסחריות. בסרטון הזה אנחנו גם להגיב על השלבים הקריטיים בתהליך ולתת הוראות מפורטות כיצד לתכנן את primers מוטגניות.

Protocol

עקרון השיטה:

האתר מכוון mutagenesis של פלסמידים שלם הסביר זה וידאו היא שיטה mutagenesis אשר מאפשר לך לשנות את הגן היעד משובטים על ידי מחיקה החלפה, או החדרה של כמה בסיסים ישירות לתוך פלסמיד. זה עובד על ידי הגברה פלסמיד שלם, בתגובה PCR מבוססי הלא thermocycling. במהלך התגובה primers מוטגניות, נושאים את המוטציה הרצויה בצורה של חוסר התאמה של הפלסמיד המקורי, משולבים פלסמיד מסונתז החדש. לאחר הסרת של הפלסמיד המקורי מן התגובה פלסמיד מוטציה מקבל להפוך E. coli. השלבים הבאים הם לצורך הקרנה בלבד, כי יעילות מוטציה של שיטה זו הוא לא 100%. ההליך כולו לוקח שלושה ימים, אבל את החלק העיקרי אפשר לעשות בתוך יום אחד.

1.0 יום אחד:

1.1 Thermocycling התגובה:

פלסמיד מקורי: אתר זה מופנה mutagenesis פרוטוקול עובד הכי טוב עם פלסמידים עד 10kb. פלסמידים גדולים יותר קצת קשה להשתנות בשיטה זו עלול לקחת קצת סבלנות והתאמת התנאים thermocycling ו / או תאים המוסמכות. יתר על פלסמיד אשר אתה עובד עם חייב להיות מבודד סכר + זן חיידקים. עבור התגובה thermocycling תצטרך 10-60 NGS של פלסמיד אתה רוצה להשתנות.

Primers: לפני שאתה יכול להגדיר thermocycling התגובה שלך אתה צריך שיהיה לך primers שלך בהישג יד. אתה צריך בערך 150 ננוגרם של פריימר כל מוטגניות. זה בסדר אם אתה לוקח 1.5 μl של מניה מדוללת 1:10 100 AM. ישנם קווים מנחים פשוטים עליך לשקול בעת תכנון primers מוטגניות שלך:

• Primers צריך להיות משלימים אחד את השני
• Primers צריך להיות בין 25 ל 45 נוקלאוטידים באורך
• מוטציות בצורה של חוסר התאמה של הפלסמיד המקורי חייב להיות הכלול primers שני
• חוסר התאמה צריכה להיות ממוקדת פריימר ואת מוקפת לפחות 8 נוקלאוטידים בכל צד
• Primers צריך GC-התוכן של 40% לפחות
• Primers צריך סוף 5 הממשלה 3 ראש הממשלה עם אחד או יותר Gs או Cs
• Primers לא צריך להיות פוספורילציה, ואין להם להיות FPLC או PAGE מטוהרים, desalted רק הם צריכים להיות.
• עבור חישוב אני לא צריך שום נוסחה, אבל אני על תעודת המשלוח צריך להיות גבוה מ 60 ° C.
• לצורך ההקרנה היא מעשית להוסיף או למחוק אתר הגבלה עם מוטציה שלך. בשל ניוון של הקוד הגנטי יש הרבה אפשרויות להוספת אתר הגבלה עם המוטציה הרצויה. אתר האינטרנט של ניו אינגלנד Biolabs מספק כלי למצוא כזה אתר הגבלה המתאים. פשוט הזן רצף פריימר שלך המקודד ברצף חומצות האמינו לך רצון, באמצעות קוד העמימות עבור ה-DNA. הכלי מוצא אנזים אגיד לך אילו אתרים הגבלה ניתן הציג במקביל המוטציה הרצויה. אם אינך יכול למצוא בכל אתר אפשרי או מגבלה מעשית על ידי כך, אתה עשוי להכניס כל אתר חדשות ללא הגבלה לגבי הקוד הגנטי באתר של המוטציה. לאחר מכן אתה יכול להשתמש פלסמיד כתבנית עבור סדרה של מוטציות אשר באתר זה הגבלה יימחקו על ידי החדרה של primers מוטגניות חדש. גישה זו עשויה להיות מאוד נוח אם אתה מתכנן לעשות סדרה של מוטציות באותו אתר של הפלסמיד.

ה-DNA פולימראז: בשיטה זו יש צורך thermostable-DNA פולימראז אשר מציג פעילות exonuclease "3'-5 ויוצר קצוות בוטה. אנחנו תמיד להשתמש רקומביננטי Pfu-פולימראז מ Fermentas. אם יש לך בעיות עם הצעדים הגברה אתה יכול לנסות פולימראז באיכות גבוהה יותר, אך לרוב המטרות Pfu רגיל יהיה מספיק. השלם את התגובה עם חיץ dNTPs פולימראז, ומים.

1.2 התנאים Thermocycling

Thermocycler יש להגדיר באופן הבא. השלב הראשוני denaturation חוזר מוגדר 30sec על 95 ° C.

הטמפרטורה חישול של primers לא חייב להיות מחושב עם נוסחאות מסובכות. אנחנו בדרך כלל להגדיר את הטמפרטורה חישול עד 55 ° C ו הזמן חישול דקה אחת. עבור primers של 25 עד 30 נוקלאוטידים אשר תשתמש בעיקר, זה עובד עבורנו 95% מהזמן. בכל אופן אם זה לא אמור לעבוד, פשוט לנסות שינוי הטמפרטורה חישול בין 50 - ו 60 ° C.

הטמפרטורה התארכות תלוי פולימראז אתה משתמש. בהפגנה זו אנו משתמשים Pfu-פולימראז מ Fermentas, הקוראת התארכות בטמפרטורה של 72 ° C. התארכות הזמן משתנה בהתאם לגודל של הפלסמיד. אנחנו תמיד לחשב 1 דקות לכל קילו, ולהוסיף דקה אחת נוספת כיהזמן. לדוגמה, עבור פלסמיד 9kb היינו בוחרים 10min כמו התארכות זמן.

18 מחזורים מספיקים כדי ליצור מוטציה מספיק פלסמיד לשימוש נוסף. שמירה על מספר מחזורי נמוך, גם חוסך לך זמן.

1.3 Gelcheck לאחר התגובה Thermocycling

הגברה מוצלח צריך להיבדק על ידי ביצוע אלקטרופורזה. מיד לאחר הרכיבה הסתיימה, עומס 5 μl התגובה על ג'ל 1% agarose טה. אם הגברה היה מוצלח, אתה צריך לראות להקה מובהק. עם זאת, אם ה-DNA מסונתז החדש אינו נראה לעין בבירור על הג'ל, אתה יכול לנסות לזרז את התגובה שלם ולהשתמש בו עבור שינוי בשלב הבא. בשבילנו זה עבד לעתים רחוקות אבל זה שווה לתת צ'אנס. הדבר הטוב ביותר לעשות אם התגובה אינה עובדת היא להתאים את הטמפרטורה חישול.

1.4 DpnI העיכול:

לפני הטרנספורמציה הפלסמיד המקורי ששימש כתבנית יש להסיר מן התגובה למנוע רקע חזק. הדבר נעשה על ידי עיכול הגבלה עם DpnI. זה endonuclease הגבלה חתכים מפוגל רק פלסמיד. ההכרה שלה ואת האתר מגבלה הוא GATC רצף ואילו חייב להיות מפוגל. כאשר לעכל עם DpnI רק פלסמיד unmutated המקורי שהיה מבודד סכר + זן מקבל לחתוך, פלסמיד מוטציה מסונתז החדש אשר אינו מפוגל אינו מושפע DpnI. כל שעליך לעשות הוא להוסיף 1-2 μl של DpnI לתגובה ו דגירה זה לפחות שעה אחת ב 37 מעלות. בעת שימוש מהיר לעכל DpnI זמן הדגירה יכול להיות ירד ל כ 15 דקות. איכות DpnI שלך ואת תקופת הדגירה של עיכול הגבלה זו קובעת כיצד חזק מאוד הרקע שלך עם הפלסמיד unmutated יהיה.

1.5 טרנספורמציה:

לאחר עיכול DpnI פלסמיד הוא מוכן לשינוי לתוך E. המוסמכת coli תאים. כל שעליך לעשות הוא להוסיף 5 μl מן התגובה העיכול DpnI לתוך התאים מוסמכת לבצע את השינוי בהתאם להמלצות במעבדה שלך. במקרה שלנו אנו משתמשים בהליך הלם חום דוגרים על ידי תערובת חיידקים פלסמיד על קרח למשך 30 דקות ולאחר מכן הלם החום אותו 42 מעלות צלזיוס למשך 90 שניות. לאחר הוספת 200 μl-SOC פתרון, החיידקים מודגרת, רועד במרץ, בשעה 37 ° C עבור 1 ח אחרי שעה 1 החיידקים הם מצופה על בחירת המדיה אגר.

2.0 יום שני

2.1 הקרנת שיבוטים חלק 1: בחירה של שיבוטים

בגלל יעילות מוטציה אינה 100% אתה צריך מסך מוטנטים שלך. אנו עושים זאת על ידי עיכול הגבלה שבו אנו לבדוק קיומו או אי קיומו של האתר מגבלה אשר הוספנו או נמחק באמצעות שילוב פריימר. לשם כך אנחנו בדרך כלל לבחור כשמונה מושבות ולגדל אותם במשך הלילה להכנת הפלסמיד למחרת.

3.0 שלושה ימים

3.1 הקרנת שיבוטים חלק 2: הגבלת העיכול עם האנזים סמן

ביום השלישי אתה מבצע הכנה מיני ועיכול הגבלה לאחר מכן האנזים עם הסמן שלך. על הג'ל אותך אז ניתן לראות בו את אחד השיבוטים שלך נושאים את המוטציה הרצויה ואלו לא.

שיטת ההקרנה באמצעות עיכול הגבלה עובד טוב מאוד. עם זאת, עליך לוודא מוטציה מוצלחת שלך על ידי רצף.

Discussion

Mutagenesis האתר מכוון הוא mutagenesis, שיטה אשר מספק דרך מהירה מוטציות הגן נישא על ידי פלסמיד. תגובה כולו יכול להיעשות ביום אחד בלבד. באמצעות שיטה זו, היא תצטרך רק זוג primers חינם נושאת את המוטציות הרצוי והגהה פולימראז כגון פולימראז-Pfu. הפלסמיד מסונתז החדש ניתן להפריד את הפלסמיד ההורים על ידי לעכל את התגובה עם DpnI האנזים הגבלה. אנזים זה מעכל רק את ה-DNA מפוגל. לכן רק פלסמיד מסונתז החדש ניתן להפוך. במדריך זה אנו הפגינו ביצוע mutagenesis האתר מכוון באמצעות ערכת mutagenesis תוצרת בית. היתרון של ערכה זו היא חיסכון בעלויות תוך יעילות נשאר. נקודות קריטיות של שיטה זו הם עיצוב פריימר ואת הטמפרטורה חישול. במקרה של ה-DNA מסונתז החדש לא ניתן דמיינו לאחר אלקטרופורזה, אשר עשוי להצביע על כשל של השיטה, אפשר לנסות לזרז את התגובה שלם ולהשתמש בו עבור הטרנספורמציה בחיידקים. עם זאת הדרך הטובה ביותר לפתור את הבעיה הזו מנסה לייעל את הטמפרטורה חישול או להגדיל את אורך האזור קבוע primers. יתר על כן, באמצעות פולימראז באיכות גבוהה או אנזים הגבלה עשויה גם לשפר את הרגישות של התגובה. התאים המוסמכת גם הם גורם מפתח אשר ההשפעות הצלחה של שיטה זו. לכן באמצע (107 דנ"א CFU / מיקרוגרם) או גבוהה (109-DNA CFU / מיקרוגרם) תאים המוסמכת עדיפים.

למרות במדריך זה אנו לא להפגין את המחיקה או הכניסה באמצעות ערכה ביתית, הצלחנו לעשות את אלה במעבדה שלנו. הצלחנו להחליף בהצלחה, להוסיף או למחוק לפחות 3 בסיסים באותו זמן.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pfu polymerase (recombinant or native)	Fermentas	EP0571 or EP0501
dNTP mix 10 mM	Fermentas	R0191
DpnI or DpnI Fast digest	Fermentas	ER1701
primers	Invitrogen		desalted