Tüm Plazmidler Homemade Sitesi Yönetmen Mutagenez

Summary

Tüm plazmid Site directed mutagenesis özgün bir plazmid biraz farklı varyasyonlarını oluşturmak için basit bir yoludur. Burada temel yerine plazmid kullanarak standart reaktifleri tanıtmak için kolay ve maliyet etkin bir şekilde göstermektedir.

Abstract

Tüm plazmid Site directed mutagenesis özgün bir plazmid biraz farklı varyasyonlarını oluşturmak için basit bir yoludur. Bu yöntem ile klonlanmış hedef gen doğrudan bir plazmid içine birkaç üslerinden ikame, silme veya ekleme tarafından değiştirilebilir. Sadece olmayan bir PCR tabanlı thermocycling reaksiyon, tüm plazmid yükseltme çalışır. Reaksiyon sırasında istenilen mutasyonu taşıyan mutajenik primerler, yeni sentezlenmiş plazmid entegre edilmiştir. Bu video öğretici bir plazmid temel yerine tanıtmak için kolay ve maliyet etkin bir şekilde göstermektedir. Protokol standart reaktifleri ile çalışır ve genellikle çok pahalı ticari kitleri, bağımsız. Bu protokolü uygulamak bazı ticari kitleri kullanılarak maliyeti ne sekizde bir tepkimenin toplam maliyetini düşürebilir. Bu video da sürecinde kritik adımlar yorum ve mutajenik primerler dizayn konusunda ayrıntılı talimatlar vermek.

Protocol

Yöntemin prensibi:

Bu site tüm plazmid mutagenez Bu video doğrudan bir plazmid içine birkaç üsleri ikamesi, silme veya ekleme klonlanmış bir hedef gen değiştirmek için izin veren bir mutagenez yöntemi açıkladı yönetti. Olmayan bir PCR tabanlı thermocycling tepki olarak, tüm plazmid yükseltme çalışır. Reaksiyon sırasında orijinal plazmid uyumsuzlukları şeklinde istenen mutasyonu taşıyan mutajenik astar, yeni sentezlenmiş plazmid entegre edilmiştir. Reaksiyon orijinal plazmid çıkarıldıktan sonra mutasyona uğramış plazmid E. dönüşmüş olur Bu yöntemin mutasyon verimliliği% 100 değildir, çünkü coli aşağıdaki adımları, sadece tarama amaçlı . Tüm prosedürü üç gün sürer, ancak ana kısmı bir gün içinde yapılabilir.

1.0 Birinci gün:

1.1 Thermocycling reaksiyon:

Orijinal Plazmid: Bu site mutagenez protokolü yönettiği 10kb için plazmid ile iyi çalışır. Büyük Plazmidler bu yöntem ile mutasyona biraz zor ve biraz sabır ve thermocycling koşullar ve / veya yetkili hücreleri ayarı alabilir. Ayrıca plazmid ile çalıştıkları bir baraj + bakteri suşu izole edilmelidir. Thermocycling reaksiyon için 10 ila 60 NGS mutasyona istediğiniz plazmid gerekecektir.

Astarlar: thermocycling tepki kurmadan önce elinizde primerler var. Her mutajenik astar yaklaşık 150 ng gerekir. 01:10 seyreltilmiş 100 pM stokunun 1.5 ul alırsak tamam. Mutajenik primerler dizayn ederken göz önünde bulundurmanız gereken birkaç basit kurallar vardır:

• Primerler birbirini tamamlayıcı olmalıdır
• Primerler uzunluğu 25 ve 45 nükleotidler arasında olmalıdır
• Orijinal plazmid uyumsuzlukları şeklinde mutasyonlar her iki astarın yer almalıdır
• Uyumsuzlukları astar merkezli ve her iki tarafta en az 8 nükleotidler tarafından çevrili olmalıdır
• Astar en az% 40 GC-İçerik olmalıdır
• Primerler, 5 başbakan, 3 başbakan, bir veya daha fazla Gs veya Cs ile bitmeli
• Primerler fosforile olmak zorunda değildir, ne de FPLC veya SAYFA saflaştırılmış, sadece olmaları gerektiği desalted olmaya gerek yok.
• Tm hesaplanması için herhangi bir formül değil, nakliye belgesi Tm 60 daha yüksek ° C olmalıdır gerekmez
• Tarama amacıyla mutasyonu ile bir kısıtlama site eklemek veya silmek için pratiktir. Çünkü genetik kod dejenerasyon istediğiniz mutasyon ile bir kısıtlama sitesine girmek için birçok olasılık vardır. New England Biolabs web sitesi, böylesine uygun bir kısıtlama site bulmak için bir araç sağlar. DNA belirsizlik kodu kullanarak, arzu amino asit dizisi için kodlama astar dizisine girmek yeterlidir. Enzim bulucu aracı kısıtlama siteleri istediğiniz mutasyon paralel olarak tanıtıldı olabilir anlatacağım. Bu şekilde, mümkün ya da pratik herhangi bir kısıtlama sitesinde bulamazsanız, mutasyon yerinde genetik kod ile ilgili yeni bir kısıtlama olmadan herhangi bir site ekleyebilirsiniz. Bundan sonra bu kısıtlamayı sitesi yeni mutajenik astar ekleme silinecek olan mutasyonlar bir dizi şablon olarak bu plazmid kullanabilirsiniz. Bu yaklaşım, aynı yerde plazmid mutasyonların bir dizi yapmak planlıyorsanız çok kullanışlı olabilir.

DNA Polimeraz: Bu yöntem için 3'-5 'eksonükleaz faaliyet gösteren ve künt uçları oluşturur thermostable DNA Polimeraz gerekir. Biz her zaman Fermentas rekombinant Pfu-Polimeraz kullanın. Amplifikasyon adımları ile ilgili sorunlar var ise daha yüksek bir kalite polimeraz deneyebilirsiniz, ama bir çok amaç için standart Pfu yeterli olacaktır. DNTP, polimeraz tampon ve su ile reaksiyona tamamlayın.

1.2 Thermocycling koşulları

PCR şu şekilde ayarlanması gerekir. Ilk ve tekrarlayan denatürasyon faz 95 ° C 30sn ayarlanır

Primerlerin tavlama sıcaklığı, karmaşık formüller ile hesaplanır olmamalıdır. Biz genellikle, tavlama sıcaklığı 55 ° C ve bir dakika tavlama zaman ayarlayın. Çoğunlukla kullanarak 25 - 30 nükleotidlerin primerler için, bu bizim için zaman% 95 çalışır. Ve 60 ° C - Bu işe gerekir Zaten, sadece tavlama sıcaklığı 50 arasında değişen deneyin

Uzama sıcaklığı kullanmak polimeraz bağlıdır. Bu gösteri biz bir uzama sıcaklığı 72 çağrıları Fermentas Pfu Polimeraz ° C. Uzama süresi plazmid büyüklüğüne göre değişir. Biz her zaman kb başına 1 dakika hesaplamak ve buna bir ekstra dakika eklemekzaman. Örneğin, bir 9KB'e plazmid uzama süresi olarak 10dk seçsin.

18 döngüleri, daha sonra kullanmak için yeterli plazmid mutasyona uğramış oluşturmak için yeterlidir. Düşük döngülerinin sayısını tutmak, aynı zamanda size zaman kazandırır.

Thermocycling reaksiyon sonra 1.3 Gelcheck

Başarılı amplifikasyon bir elektroforez yaparak kontrol edilmelidir. Bisiklet bittikten sonra doğrudan reaksiyon 5 ul,% 1 TAE agaroz jel üzerine yerleştirin. Amplifikasyon başarılı olursa, farklı bir bant göreceksiniz. Ancak, yeni sentezlenen DNA jel üzerinde açıkça görünür değilse, bütün tepki çökelmesine denemek ve bir sonraki adım dönüşüm için kullanabilirsiniz. Bizim için bu, nadiren çalıştı ama denemeye değer. Reaksiyon işe yaramazsa, yapılacak en iyi şey, tavlama sıcaklığını ayarlamak için.

1.4 DpnI sindirim:

Dönüşüm reaksiyon güçlü bir arka plan önlemek için önce bir şablon olarak görev orijinal plazmid uzaklaştırılmalıdır. Bu DpnI ile sınırlama sindirim yapılır. Bu kısıtlama endonükleaz sadece plazmid metil keser. Bir metil sahipken, tanıma ve kısıtlama sitesi sırası GAİK. DpnI ile sindirerek zaman sadece bir baraj izole edildiği orijinal unmutated plazmid + suşu kesim alır, metil değil, yeni sentezlenmiş mutasyona uğramış plazmid DpnI etkilenmez. Sadece reaksiyon 1-2 ul DpnI eklemek ve en az bir saat inkübe 37 ° °. Hızlı sindirimi DpnI kullanarak kuluçka süresi yaklaşık 15 dakika azaltılabilir. DpnI ve bu kısıtlamanın sindirim inkübasyon süresi kalitesi, büyük ölçüde unmutated plazmid ile arka plan ne kadar güçlü olacaktır belirler.

1.5 Dönüşüm:

DpnI sindirim sonra plazmid yetkili E. dönüşebilmesi için hazır coli hücrelerinde. Sadece yetkili hücrelerin içine DpnI sindirim reaksiyon 5 ul eklemek ve laboratuarda önerildiği gibi, dönüşümü gerçekleştirmek. Bizim durumumuzda bu plazmid bakteri karışımı 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe ve sonra 42 ° C'de 90 sn ısı şok ısı şok yordamı kullanın. 200 ul SOC çözüm ekledikten sonra, bakteri, şiddetle, 1 saat boyunca 37 ° C sallayarak inkübe edilir 1 saat sonra bakterilerin agar ortamı seçme kaplanmıştır.

2.0 Gün iki

2.1 klonlar parçası 1 Eleme: klonların seçimi

Çünkü mutasyon verimi% 100 değildir, sizin mutantlar için ekran gerekir. Biz bunu biz eklenen veya astar entegrasyon yoluyla silinen kısıtlama sitenin varlığı ya da yokluğu kontrol sınırlama sindirim. Bu amaçla genellikle sekiz koloniler pick up ve ertesi gün plazmid hazırlık için onları gece boyunca büyüyecek.

3,0 Gün üç

3.1 klonlar parçası 2 Tarama: Kısıtlama belirteç enzim ile sindirim

Üçüncü gününde belirteç enzim Mini Hazırlık ve sonraki sınırlama sindirim gerçekleştirin. Jel sonra istenilen mutasyon taşıyan ve hangilerinin klonların hangisinin görebilirsiniz.

Sınırlama sindirim kullanarak tarama yöntemi çok iyi çalışıyor. Bununla birlikte, sıralama başarılı mutasyon olduğunu teyit etmelidir.

Discussion

Sitesi directed mutagenesis bir plazmid tarafından taşınan bir gen mutasyona hızlı bir şekilde sağlayan bir mutagenez yöntemdir. Tüm reaksiyon sadece bir gün içinde yapılabilir. Bu yöntemle, istenilen mutasyonları taşıyan ücretsiz primerler sadece bir çift ve Pfu-Polimeraz gibi bir redaksiyon polimeraz gerekecektir. Yeni sentezlenmiş plazmid restriksiyon enzim DpnI ile reaksiyon sindirerek ebeveyn plazmid ayrılabilir. Bu enzim sadece metillenmiş DNA sindirir. Bu nedenle sadece yeni sentezlenmiş plazmid dönüştürülebilir. Bu eğitimde ev yapımı bir mutagenez kiti kullanarak bir site directed mutagenesis performans gösterdi. Bu kitin faydası, etkinliği kalırken maliyet tasarrufu. Bu yöntemin kritik noktaları astar tasarım ve tavlama sıcaklığı. Durumda, yeni sentezlenen DNA elektroforez sonra, hangi yöntemin başarısızlık gösterebilir, bir bakteri dönüşüm için tüm reaksiyon ve kullanılması, çöktürmek için deneyebilirsiniz görüntülenmiştir olamaz. Ancak bu sorunu çözmek için en iyi yolu, tavlama sıcaklığı optimize veya primerler sabit bölgenin uzunluğunu artırmak için çalışıyor. Ayrıca, yüksek kaliteli bir polimeraz veya restriksiyon enzimi kullanarak da reaksiyon duyarlılığı artırabilir. Yetkili hücreler de, bu yöntemin successfulness etkileri önemli bir faktördür. Bu nedenle, orta (107 kob / mg DNA) veya yüksek (109 kob / mg DNA) yetkili hücreleri tercih edilir.

Bu eğitimde ev kitini kullanarak silme veya ekleme göstermek olmasa da, biz bu laboratuvarda yapmak için başarılı olmuştur. Biz, aynı zamanda başarılı bir şekilde en az 3 üsleri, yedek eklemek veya silmek için başardık.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pfu polymerase (recombinant or native)	Fermentas	EP0571 or EP0501
dNTP mix 10 mM	Fermentas	R0191
DpnI or DpnI Fast digest	Fermentas	ER1701
primers	Invitrogen		desalted