Summary
Plaatsgerichte mutagenese van hele plasmiden is een eenvoudige manier om iets verschillende varianten van een origineel plasmide te creëren. Hier laten we zien op een eenvoudige en kosteneffectieve manier om de base substituties te introduceren in een plasmide met behulp van standaard reagentia.
Abstract
Plaatsgerichte mutagenese van hele plasmiden is een eenvoudige manier om iets verschillende varianten van een origineel plasmide te creëren. Met deze methode wordt de gekloonde doelwitgen kan worden gewijzigd door substitutie, deletie of insertie van een paar bases direct in een plasmide. Het werkt door simpelweg het versterken van de hele plasmide, in een niet PCR-gebaseerde thermocycling reactie. Tijdens de reactie mutagene primers, het dragen van de gewenste mutatie, zijn geïntegreerd in de nieuw gesynthetiseerde plasmide. In deze video tutorial tonen we aan een eenvoudige en kosteneffectieve manier om de base substituties introduceren in een plasmide. Het protocol werkt met standaard reagentia en is onafhankelijk van commerciële kits, die vaak erg duur. Toepassing van dit protocol kan de totale kosten van een reactie op een achtste van wat het kost met behulp van enkele van de commerciële kits. In deze video hebben we ook commentaar geven op kritische stappen tijdens het proces en geeft gedetailleerde instructies over hoe de mutagene primers te ontwerpen.
Protocol
Principe van de methode:
De site mutagenese van hele plasmiden uitgelegd in deze video is een mutagenese methode die stelt u in staat te veranderen een gekloond target-gen door substitutie, deletie of insertie van een paar bases direct in een plasmide. Het werkt door het versterken van de hele plasmide, in een niet PCR-gebaseerde thermocycling reactie. Tijdens de reactie mutagene primers, het dragen van de gewenste mutatie in de vorm van mismatches op de oorspronkelijke plasmide, zijn geïntegreerd in de nieuw gesynthetiseerde plasmide. Na verwijdering van de oorspronkelijke plasmide uit de reactie van het gemuteerde plasmide wordt getransformeerd in E. coli. De volgende stappen zijn voor screening doeleinden, omdat de mutatie efficiëntie van deze methode is niet 100%. De hele procedure duurt drie dagen, maar het grootste deel kan worden gedaan binnen een dag.
1,0 Dag een:
1.1 thermocycling reactie:
Originele Plasmide: Deze site mutagenese protocol werkt het beste met plasmiden tot 10KB. Grotere Plasmiden zijn een beetje moeilijk te muteren met deze methode en kan wat geduld en aanpassing van de thermocycling voorwaarden en / of de bevoegde cellen nemen. Verder is de plasmide waarin u werkt met een moet worden geïsoleerd van een dam + bacterie stam. Voor de thermocycling reactie moet u 10 tot 60 NGS van het plasmide dat u wilt muteren.
Primers: Voordat u kunt uw reactie thermocycling u uw primers bij de hand. Je hebt ongeveer 150 ng van elke mutagene primer. Het is ok als je 1,5 pi van een 1:10 verdunde 100 pM voorraad. Er zijn een paar eenvoudige richtlijnen die je moet overwegen bij het ontwerpen van uw mutagene primers:
- De primers moet complementair zijn aan elkaar
- De primers moet tussen de 25 en 45 nucleotiden in lengte
- De mutaties in de vorm van mismatches op de oorspronkelijke plasmide moet worden opgenomen in beide primers
- De mismatches moet in het midden in de primer en geflankeerd door ten minste 8 nucleotiden aan elke kant
- De primers moet een GC-gehalte van ten minste 40%
- De primers moet eindigen 5 prime en prime 3 met een of meer Gs of CS
- De primers hoeven niet te worden gefosforyleerd, noch hebben ze te worden FPLC of PAGE gezuiverd, alleen ontzout ze zouden moeten zijn.
- Voor de berekening van Tm je hebt geen formule, maar Tm op de verzendkosten certificaat moet hoger dan 60 ° C.
- Voor de screening is het handig om te voegen of een beperking site te verwijderen met uw mutatie. Door de degeneratie van de genetische code zijn er vele mogelijkheden om een beperking website invoegen met de gewenste mutatie. De website van de New England Biolabs is een hulpmiddel om zo'n geschikte restrictie-site te vinden. Voer uw primer sequentie die codeert voor de aminozuursequentie die u wenst, het gebruik van de dubbelzinnigheid code voor DNA. Het enzym finder tool zal u vertellen welke restrictie sites kunnen parallel worden geïntroduceerd om de gewenste mutatie. Als u alle mogelijke beperking of praktisch site niet te vinden door op deze manier, kun je elk nieuwe beperking website plaatsen, zonder met betrekking tot de genetische code op de plaats van mutatie. Daarna kunt u dit plasmide als sjabloon voor een reeks van mutaties waarin deze beperking site zal worden verwijderd door het inbrengen van de nieuwe mutagene primers. Deze benadering kan erg handig zijn als je van plan bent om een reeks van mutaties doen op dezelfde locatie van het plasmide.
DNA-polymerase: Voor deze methode moet je een thermostabiel DNA-polymerase dat 3'-5 'exonuclease activiteit vertoont en creëert stompe uiteinden. Wij gebruiken altijd recombinant Pfu-polymerase van Fermentas. Als je hebt problemen met de versterking stappen die u kunt proberen een hogere kwaliteit polymerase, maar voor de meeste doeleinden de standaard Pfu zal genoeg zijn. Vul de reactie met dNTPs, polymerase buffer en water.
1.2 thermocycling voorwaarden
De thermocycler moet worden ingesteld op de volgende manier. De initiële en terugkerende denaturatie fase is ingesteld op 30 seconden bij 95 ° C.
De annealing temperatuur van de primers mag niet worden berekend met ingewikkelde formules. We meestal zet de annealing temperatuur tot 55 ° C en de annealing tijd om een minuut. Voor de primers van 25 tot 30 nucleotiden die je meestal gebruikt, dit werkt voor ons 95% van de tijd. Hoe dan ook als dit niet zou werken, probeer dan alleen het variëren van de annealing temperatuur tussen 50 - en 60 ° C.
De rek temperatuur hangt af van de polymerase die u gebruikt. In deze demonstratie gebruiken we de Pfu-polymerase van Fermentas, waarin wordt opgeroepen tot een verlenging temperatuur van 72 ° C. De rek varieert volgens de grootte van het plasmide. We hebben altijd rekenen 1 min per kb, en voeg een extra minuten om dattijd. Bijvoorbeeld, voor een 9KB plasmide we zouden kiezen voor 10min als rek de tijd.
18 cycli voldoende zijn om aan voldoende plasmide gemuteerd voor het verder gebruik. Houden van het aantal cycli laag is, ook bespaart u tijd.
1.3 Gelcheck na thermocycling reactie
De succesvolle versterking moet worden gecontroleerd door het uitvoeren van een elektroforese. Direct na het fietsen klaar is, belasting 5 ul van de reactie op een 1% TAE agarose gel. Als de versterking succesvol was, moet u een aparte band. Maar als de nieuw gesynthetiseerde DNA is niet duidelijk zichtbaar op de gel, kunt u proberen het neerslaan van de hele reactie en het gebruiken voor transformatie in de volgende stap. Voor ons heeft dit zelden gewerkt, maar het is de moeite waard om een poging te geven. Het beste wat te doen als de reactie niet werkt is het aanpassen van de annealing temperatuur.
1.4 DpnI spijsvertering:
Voor de transformatie van de oorspronkelijke plasmide die diende als een mal moet worden verwijderd uit de reactie op sterke achtergrond te voorkomen. Dit wordt gedaan door restrictievertering met DpnI. Deze beperking endonuclease snijdt alleen plasmide gemethyleerd. De erkenning en de beperking site is de volgorde GATC terwijl A moet worden gemethyleerd. Bij het verteren met DpnI alleen de originele ongemuteerde plasmide dat werd geïsoleerd uit een dam + stam wordt gesneden, de nieuw gesynthetiseerde gemuteerde plasmide die niet gemethyleerd niet beïnvloed door DpnI. Voeg eenvoudig 1-2 pl DpnI om de reactie en incubeer het minstens een uur bij 37 °. Bij het gebruik van de Fast verteren DpnI de incubatietijd kan worden verminderd tot ongeveer 15 minuten. De kwaliteit van uw DpnI en de incubatietijd van deze beperking vertering bepaalt sterk hoe sterk je achtergrond met gemuteerde plasmide zal zijn.
1.5 Transformatie:
Na DpnI spijsvertering het plasmide is klaar voor transformatie naar de bevoegde E. coli-cellen. Voeg gewoon 5 pi van de DpnI spijsvertering reactie in de competente cellen en het uitvoeren van de transformatie, zoals aanbevolen in uw lab. In ons geval gebruiken we de warmte shock procedure door het incuberen van de bacterie-plasmide mengsel op ijs gedurende 30 minuten en daarna heat shock is bij 42 ° C gedurende 90 sec. Na het toevoegen van 200 pi SOC-oplossing, zijn de bacteriën geïncubeerd, krachtig schudden, bij 37 ° C gedurende 1 uur Na 1 uur zijn de bacteriën uitgeplaat op het selecteren van agar media.
2,0 Dag twee
2.1 Screening van klonen deel 1: Selectie van klonen
Omdat de mutatie rendement is niet 100% je nodig hebt om het scherm voor uw mutanten. We doen dit door restrictievertering waarin we controleren op de aanwezigheid of afwezigheid van de beperking site die we toegevoegd of verwijderd door middel van primer integratie. Voor dit doel hebben we meestal halen acht kolonies en groeien ze over 's nachts voor plasmide voorbereiding op de volgende dag.
3,0 Dag drie
3.1 Screening van klonen deel 2: Beperking knippen met marker enzym
Op de derde dag het uitvoeren van een Mini-Prep en de daaropvolgende restrictievertering met je marker enzym. Op de gel je dan kunt zien welke van je klonen dragen de gewenste mutatie en welke niet degenen.
De screening methode met restrictievertering werkt erg goed. Toch moet u uw succesvolle mutatie te bevestigen door sequentiebepaling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Plaatsgerichte mutagenese is een mutagenese-methode die een snelle manier om een gen gedragen door een plasmide muteren biedt. De hele reactie kan worden gedaan in slechts een dag. Met deze methode, zal het nodig hebben alleen maar een paar gratis primers het dragen van de gewenste mutaties en een proeflezen polymerase zoals Pfu-Polymerase. De nieuw gesynthetiseerde plasmide kan worden gescheiden van het ouderlijk plasmide door verteren de reactie met het restrictie-enzym DpnI. Dit enzym verteert alleen de gemethyleerd DNA. Dus alleen de nieuw gesynthetiseerde plasmide kan worden getransformeerd. In deze tutorial hebben we aangetoond het uitvoeren van een plaatsgerichte mutagenese met behulp van een zelfgemaakte mutagenese kit. Het voordeel van deze kit is de kostenbesparing, terwijl de effectiviteit blijft. De kritische punten van deze methode zijn de primer ontwerp en de annealing temperatuur. In het geval dat de nieuw gesynthetiseerde DNA niet kan worden gevisualiseerd na elektroforese, die het falen van de methode aan te geven, kan men proberen om het neerslaan van de hele reactie en het gebruiken voor transformatie in bacteriën. Maar de beste manier om dit probleem op te lossen is proberen de annealing temperatuur te optimaliseren of de lengte van de constante regio in de primers te verhogen. Verder kan met behulp van een hoge kwaliteit-polymerase of restrictie-enzym verbeteren ook de gevoeligheid van de reactie. De competente cellen zijn ook een belangrijke factor die de successfulness van deze methode-effecten. Daarom midden (107 cfu / ug DNA) of sterk (109 cfu / ug DNA) competente cellen zijn voorkeur.
Hoewel in deze tutorial hebben we niet tonen de deletie of insertie met behulp van de zelfgemaakte kit zijn we erin geslaagd om deze te doen in ons laboratorium. We waren in staat om met succes vervangen, invoegen of op zijn minst drie bases te verwijderen op hetzelfde moment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pfu polymerase (recombinant or native) | Fermentas | EP0571 or EP0501 | |
| dNTP mix 10 mM | Fermentas | R0191 | |
| DpnI or DpnI Fast digest | Fermentas | ER1701 | |
| primers | Invitrogen | desalted |
References
- Papworth, C., Bauer, J. C., Braman, J., Wright, D. A. QuikChange site-directed mutagenesis. Strategies. 9, 3-4 (1996).
