Summary
साइट पूरे plasmids के निर्देशित mutagenesis के एक मूल प्लाज्मिड थोड़ा अलग अलग रूपों बनाने के लिए एक सरल तरीका है. हम यहाँ एक आसान और लागत प्रभावी एक प्लाज्मिड का उपयोग कर मानक अभिकर्मकों में आधार substitutions के परिचय के लिए रास्ता प्रदर्शित करता है.
Abstract
साइट पूरे plasmids के निर्देशित mutagenesis के एक मूल प्लाज्मिड थोड़ा अलग अलग रूपों बनाने के लिए एक सरल तरीका है. इस विधि के साथ क्लोन लक्ष्य जीन प्रतिस्थापन, या एक प्लाज्मिड में सीधे कुछ ठिकानों का विलोपन प्रविष्टि के द्वारा बदला जा सकता है. यह बस एक गैर thermocycling पीसीआर आधारित प्रतिक्रिया में, पूरे प्लाज्मिड amplifying द्वारा काम करता है है. प्रतिक्रिया के दौरान mutagenic प्राइमरों, इच्छित उत्परिवर्तन ले, नए संश्लेषित प्लाज्मिड में एकीकृत कर रहे हैं. में इस वीडियो ट्यूटोरियल हम एक आसान और लागत प्रभावी करने के लिए एक प्लाज्मिड में आधार substitutions परिचय प्रदर्शित करता है. प्रोटोकॉल मानक अभिकर्मकों के साथ काम करता है और वाणिज्यिक किट, जो अक्सर बहुत महंगे हैं से स्वतंत्र है. इस प्रोटोकॉल लागू यह क्या वाणिज्यिक किट के कुछ का उपयोग की लागत का एक आठवीं के लिए एक प्रतिक्रिया की कुल लागत को कम कर सकते हैं. इस वीडियो में हम भी इस प्रक्रिया के दौरान महत्वपूर्ण कदम पर टिप्पणी और कैसे mutagenic प्राइमरों डिजाइन करने के लिए पर विस्तृत निर्देश दे.
Protocol
विधि का सिद्धांत:
साइट का निर्देशन पूरे plasmids के mutagenesis के इस वीडियो में एक mutagenesis के विधि है जो आप एक प्रतिस्थापन, या कुछ ठिकानों का विलोपन प्रविष्टि के द्वारा क्लोन एक प्लाज्मिड में सीधे लक्ष्य जीन को बदलने की अनुमति देता है समझाया. यह एक गैर thermocycling पीसीआर आधारित प्रतिक्रिया में, पूरे प्लाज्मिड amplifying द्वारा काम करता है. प्रतिक्रिया के दौरान mutagenic प्राइमरों, बेमेल के रूप में मूल प्लाज्मिड वांछित उत्परिवर्तन ले जाने, नए संश्लेषित प्लाज्मिड में एकीकृत कर रहे हैं. मूल प्लाज्मिड की प्रतिक्रिया से हटाने के बाद mutated प्लाज्मिड ई. में तब्दील हो जाता है कोलाई निम्नलिखित कदम स्क्रीनिंग प्रयोजनों के लिए ही कर रहे हैं, क्योंकि इस विधि का उत्परिवर्तन क्षमता 100% नहीं है. पूरी प्रक्रिया में तीन दिन लगते हैं, लेकिन मुख्य भाग के एक दिन के भीतर किया जा सकता है है.
1.0 एक दिन:
1.1 Thermocycling प्रतिक्रिया:
मूल प्लाज्मिड: इस साइट mutagenesis के प्रोटोकॉल निर्देशित 10kb करने के लिए ऊपर plasmids के साथ सबसे अच्छा काम करता है . बड़ा प्लास्मिड एक बिट के लिए इस विधि के साथ रूपांतरित होना मुश्किल कर रहे हैं और कुछ धैर्य और thermocycling शर्तों और / या सक्षम कोशिकाओं के समायोजन ले सकता है. इसके अलावा प्लाज्मिड जो आप के साथ काम + बांध बैक्टीरिया तनाव से अलग होना चाहिए. Thermocycling प्रतिक्रिया के लिए आप प्लाज्मिड आप के रूप बदलना चाहते हैं 10 से 60 ngs की आवश्यकता होगी.
प्राइमर्स: इससे पहले कि आप अपने thermocycling प्रतिक्रिया सेट कर सकते हैं आप हाथ में अपने प्राइमरों है. आप हर mutagenic प्राइमर के बारे में 150 एनजी की जरूरत है. यह ठीक है अगर आप 1:10 पतला 100 PM स्टॉक के 1.5 μl ले. वहाँ कुछ सरल दिशा निर्देशों आप जब अपने mutagenic प्राइमरों डिजाइन पर विचार करना चाहिए रहे हैं:
- प्राइमरों एक दूसरे के पूरक होना चाहिए
- प्राइमरों लंबाई में 25 और 45 nucleotides के बीच होना चाहिए
- मूल प्लाज्मिड बेमेल के रूप में परिवर्तन दोनों प्राइमरों में निहित होना चाहिए
- बेमेल प्राइमर में केंद्रित किया जाना चाहिए और प्रत्येक पक्ष पर कम से कम 8 nucleotides द्वारा flanked
- प्राइमरों कम से कम 40% की जीसी सामग्री चाहिए
- प्राइमरों 5 प्रधानमंत्री और तीन प्रधानमंत्री के साथ एक या एक से अधिक जी या Cs अंत होना चाहिए
- प्राइमरों की जरूरत नहीं है phosphorylated है, न ही वे FPLC या PAGE विशुद्ध, केवल desalted वे किया जाना चाहिए किया जाना है.
- Tm की गणना के लिए आप किसी सूत्र लेकिन Tm शिपिंग प्रमाण पत्र पर 60 से अधिक होना चाहिए डिग्री सेल्सियस की जरूरत नहीं है
- स्क्रीनिंग प्रयोजनों के लिए यह व्यावहारिक है सम्मिलित करने के लिए या अपने उत्परिवर्तन के साथ प्रतिबंध साइट को हटाना. आनुवंशिक कोड के अध: पतन की वजह से वहाँ कई संभावनाओं करने के लिए अपने वांछित परिवर्तन के साथ प्रतिबंध साइट सम्मिलित हैं. न्यू इंग्लैंड Biolabs की वेबसाइट पर इस तरह के एक उचित प्रतिबंध साइट खोजने के लिए एक उपकरण प्रदान करता है. बस अपने प्राइमर अमीनो एसिड अनुक्रम आप की इच्छा के लिए कोडिंग, अनुक्रम डीएनए के लिए अस्पष्टता कोड का उपयोग कर दर्ज करें. एंजाइम खोजक उपकरण आपको बता सकते हैं जो प्रतिबंध साइटों अपने वांछित परिवर्तन के लिए समानांतर शुरू कर सकते हैं होगा. यदि आप इस तरह से किसी भी संभव या व्यावहारिक प्रतिबंध साइट नहीं मिल सकता है, तो आप साइट पर उत्परिवर्तन के आनुवंशिक कोड के विषय में बिना किसी भी नए प्रतिबंध साइट सम्मिलित हो सकता है. इसके बाद आप इस म्यूटेशनों की एक श्रृंखला है, जो में इस प्रतिबंध साइट में नए mutagenic प्राइमरों के सम्मिलन से हटा दिया जाएगा के लिए टेम्पलेट के रूप में प्लाज्मिड उपयोग कर सकते हैं. यह दृष्टिकोण बहुत सुविधाजनक हो सकता है अगर आप प्लाज्मिड के एक ही साइट पर परिवर्तन की एक श्रृंखला की योजना बना रहे हैं हो सकता है.
डीएनए पोलीमरेज़: इस विधि के लिए आप एक थर्मास्टाइबल डीएनए पोलीमरेज़ है जो '3'-5 exonuclease गतिविधि दर्शाती है और मुँहफट समाप्त होता है बनाता है की जरूरत है . हम हमेशा Fermentas से पुनः संयोजक Pfu - पोलीमरेज़ का उपयोग करें. यदि आप प्रवर्धन कदम के साथ समस्याओं को मिला है आप एक उच्च गुणवत्ता पोलीमरेज़ की कोशिश करो, लेकिन हो सकता है सबसे प्रयोजनों के लिए मानक Pfu पर्याप्त होगा. DNTPs, पोलीमरेज़ बफर और पानी के साथ प्रतिक्रिया को पूरा करें.
1.2 Thermocycling शर्तों
thermocycler निम्नलिखित तरीके में स्थापना की जानी चाहिए. प्रारंभिक और आवर्ती विकृतीकरण चरण 95 डिग्री सेल्सियस पर 30sec के लिए सेट कर दिया जाता है
प्राइमरों की annealing तापमान जटिल फार्मूले के साथ गणना नहीं करना चाहिए. हम आम तौर पर annealing तापमान 55 डिग्री सेल्सियस और annealing एक मिनट के लिए समय निर्धारित किया है. जो आप ज्यादातर का उपयोग किया जाएगा 25 से 30 nucleotides के प्राइमरों के लिए, यह हमारे लिए समय के 95% काम करता है. और 60 डिग्री सेल्सियस - किसी भी तरह अगर यह काम नहीं करना चाहिए, बस 50 के बीच annealing तापमान अलग - अलग करने की कोशिश
बढ़ाव तापमान पोलीमरेज़ आप उपयोग पर निर्भर करता है है. इस प्रदर्शन में हम Pfu - Fermentas से पोलीमरेज़ ° है जो 72 के एक बढ़ाव तापमान लिए कॉल सी. का उपयोग बढ़ाव समय प्लाज्मिड के आकार के अनुसार भिन्न होता है. हम हमेशा केबी प्रति एक मिनट की गणना, और कहा कि एक अतिरिक्त मिनट जोड़नेसमय है. उदाहरण के लिए, एक 9kb प्लाज्मिड के लिए हम बढ़ाव समय के रूप में 10min चुनना होगा.
18 चक्र बनाने के लिए पर्याप्त आगे उपयोग के लिए प्लाज्मिड उत्परिवर्तित के लिए पर्याप्त हैं. कम चक्र की संख्या में रखते हुए, यह भी आप समय बचाता है.
1.3 Gelcheck बाद Thermocycling प्रतिक्रिया
सफल प्रवर्धन एक वैद्युतकणसंचलन प्रदर्शन द्वारा जाँच की जानी चाहिए. सीधे के बाद साइकिल समाप्त हो गया है, एक 1% TAE agarose जेल पर प्रतिक्रिया के 5 μl लोड. अगर प्रवर्धन सफल रहा था, आप एक अलग बैंड देखना चाहिए. लेकिन अगर नव संश्लेषित डीएनए जेल पर स्पष्ट रूप से दिखाई नहीं है, तो आप पूरे प्रतिक्रिया वेग कोशिश करते हैं और यह अगले कदम में परिवर्तन के लिए उपयोग कर सकते हैं. हमारे लिए यह शायद ही कभी काम किया है लेकिन यह एक कोशिश देने लायक है. सबसे अच्छी बात अगर प्रतिक्रिया नहीं काम करता है annealing तापमान को समायोजित करने के लिए है.
1.4 DpnI पाचन:
परिवर्तन से पहले मूल प्लाज्मिड जो एक टेम्पलेट के रूप में सेवा की प्रतिक्रिया के लिए मजबूत पृष्ठभूमि को रोकने से हटाया जाना चाहिए. यह DpnI के साथ प्रतिबंध पाचन द्वारा किया जाता है. यह प्रतिबंध endonuclease कटौती केवल प्लाज्मिड methylated. इसकी मान्यता और प्रतिबंध साइट अनुक्रम GATC है जबकि एक के लिए methylated हो गया है. जब DpnI साथ पचा ही मूल unmutated प्लाज्मिड जो बांध से अलग किया गया था + तनाव कट जाता है, नए संश्लेषित उत्परिवर्तित प्लाज्मिड DpnI जो नहीं methylated है से प्रभावित नहीं है. बस प्रतिक्रिया DpnI के 1-2 μl को जोड़ने और 37 पर यह कम से कम एक घंटे सेते °. जब फास्ट पचाने में DpnI ऊष्मायन समय का उपयोग के बारे में 15 मिनट के लिए कम किया जा सकता है है. अपने DpnI और इस प्रतिबंध पाचन की ऊष्मायन समय की गुणवत्ता काफी निर्धारित करता है कैसे मजबूत unmutated प्लाज्मिड के साथ अपनी पृष्ठभूमि जाएगा.
1.5 परिवर्तन:
DpnI पाचन के बाद प्लाज्मिड सक्षम ई. में परिवर्तन के लिए तैयार है कोलाई कोशिकाओं. बस DpnI पाचन प्रतिक्रिया से सक्षम कोशिकाओं में 5 μl और परिवर्तन जोड़ने के प्रदर्शन के रूप में अपनी प्रयोगशाला में सिफारिश. हमारे मामले में हम 30 मिनट के लिए बर्फ पर मिश्रण बैक्टीरिया प्लाज्मिड incubating और फिर 90 के लिए 42 डिग्री सेल्सियस सेकंड में गर्मी झटका गर्मी झटका प्रक्रिया का उपयोग करें. 200 μl समाज समाधान जोड़ने के बाद, बैक्टीरिया incubated हैं, सख्ती 37 में मिलाते हुए, एच. 1 डिग्री सेल्सियस 1 घंटे के बाद बैक्टीरिया अगर मीडिया के चयन पर चढ़ाया जाता है.
2.0 दो दिन
2.1 क्लोन भाग 1 की स्क्रीनिंग: क्लोनों का चयन
क्योंकि उत्परिवर्तन दक्षता 100% नहीं है आप अपने म्यूटेंट के लिए स्क्रीन की जरूरत है. हम प्रतिबंध पाचन जिसमें हम जो हम जोड़ा या प्राइमर एकीकरण के माध्यम से हटाए गए प्रतिबंध साइट की उपस्थिति या अनुपस्थिति के लिए की जाँच करें द्वारा इस करते हैं. इस प्रयोजन के लिए हम आम तौर पर आठ कालोनियों लेने और रात में उन्हें अगले दिन पर प्लाज्मिड तैयारी के लिए विकसित.
3.0 तीन दिन
क्लोन भाग 2 के 3.1 स्क्रीनिंग: मार्कर एंजाइम के साथ प्रतिबंध पाचन
तीसरे दिन आप एक मिनी और अपने मार्कर एंजाइम के साथ बाद प्रतिबंध पाचन तैयारी करते हैं. जेल में तो आप देख सकते हैं अपने क्लोनों में से एक है जो वांछित उत्परिवर्तन ले और लोगों को जो नहीं है.
स्क्रीनिंग प्रतिबंध पाचन पद्धति का उपयोग करके बहुत अच्छी तरह से काम करता है. फिर भी, आप अनुक्रमण द्वारा अपने सफल उत्परिवर्तन की पुष्टि करना चाहिए.
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Discussion
साइट निर्देशित mutagenesis के एक mutagenesis के विधि है जो एक तेजी से एक प्लाज्मिड द्वारा किए गए जीन रूप बदलना तरीका प्रदान करता है. पूरे प्रतिक्रिया केवल एक दिन में किया जा सकता है. इस विधि के साथ, यह केवल मानार्थ प्राइमरों वांछित म्यूटेशनों ले जाने की एक जोड़ी और Pfu - पोलीमरेज़ जैसे proofreading पोलीमरेज़ की आवश्यकता होगी. नए संश्लेषित प्लाज्मिड प्रतिबंध एंजाइम DpnI के साथ प्रतिक्रिया पचाने के द्वारा माता - पिता प्लाज्मिड से अलग किया जा सकता है. यह एंजाइम केवल डीएनए methylated हज़म. इसलिए केवल नए संश्लेषित प्लाज्मिड तब्दील किया जा सकता है. इस ट्यूटोरियल में हम एक घर mutagenesis किट का उपयोग करके एक साइट निर्देशित mutagenesis के प्रदर्शन का प्रदर्शन किया. इस किट के लाभ लागत बचत जबकि प्रभावशीलता रहता है. इस विधि के महत्वपूर्ण बिंदुओं प्राइमर डिजाइन और annealing तापमान हैं. मामले में नए संश्लेषित डीएनए कल्पना नहीं वैद्युतकणसंचलन के बाद, जो विधि की विफलता का संकेत हो सकता है, एक पूरी और बैक्टीरिया में परिवर्तन के लिए इसे का उपयोग करें प्रतिक्रिया वेग की कोशिश कर सकते हैं कर सकते हैं. हालांकि इस समस्या को हल करने का सबसे अच्छा तरीका annealing तापमान का अनुकूलन या प्राइमरों में लगातार क्षेत्र की लंबाई में वृद्धि की कोशिश कर रहा है. इसके अलावा, एक उच्च गुणवत्ता पोलीमरेज़ या प्रतिबंध एंजाइम का उपयोग भी प्रतिक्रिया की संवेदनशीलता में सुधार हो सकता है. सक्षम कोशिकाओं को भी एक महत्वपूर्ण कारक है जो इस विधि का successfulness प्रभाव हैं. इसलिए (107 cfu / μg डीएनए) मध्यम या उच्च (109 cfu / μg डीएनए) सक्षम कोशिकाओं बेहतर कर रहे हैं.
हालांकि इस ट्यूटोरियल में हम विलोपन या घर का बना किट का उपयोग करके प्रविष्टि प्रदर्शित नहीं किया है, हम हमारी प्रयोगशाला में इन सफल रहे थे. हम को सफलतापूर्वक विकल्प, सम्मिलित या एक ही समय में कम से कम 3 अड्डों हटाने के करने में सक्षम थे.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pfu polymerase (recombinant or native) | Fermentas | EP0571 or EP0501 | |
| dNTP mix 10 mM | Fermentas | R0191 | |
| DpnI or DpnI Fast digest | Fermentas | ER1701 | |
| primers | Invitrogen | desalted |
References
- Papworth, C., Bauer, J. C., Braman, J., Wright, D. A. QuikChange site-directed mutagenesis. Strategies. 9, 3-4 (1996).
