Summary
Сайт направленного мутагенеза целых плазмид простой способ создать несколько различных вариантов оригинальных плазмиды. Здесь мы показываем, простой и экономически эффективный способ представить база замен в плазмиду с использованием реагентов стандарта.
Abstract
Сайт направленного мутагенеза целых плазмид простой способ создать несколько различных вариантов оригинальных плазмиды. С помощью этого метода клонировали ген-мишень может быть изменено, замена, удаление или вставка нескольких баз непосредственно в плазмиды. Он работает, просто усиливать все плазмиды, в не на основе ПЦР термоциклирования реакции. Во время реакции мутагенных праймеров, несущих желаемые мутации, интегрированы в вновь синтезированных плазмиды. В этом видео-учебник мы покажем простой и экономически эффективный способ представить база замен в плазмиды. Протокол работает со стандартными реагентами и не зависит от коммерческих наборов, которые часто стоят очень дорого. Применение этого протокола может сократить общую стоимость реакция на восьмом, что это стоит, используя некоторые из коммерческих наборов. В этом видео мы также прокомментировать критические шаги в процессе и дать подробные инструкции о том, как дизайн мутагенных праймеров.
Protocol
Принцип метода:
Сайт направленного мутагенеза целых плазмид, приведенными в этом видео мутагенеза метод, который позволяет вам изменять клонировали ген-мишень путем замены, удаления или вставки нескольких баз непосредственно в плазмиды. Она работает путем усиления целом плазмиды, в не на основе ПЦР термоциклирования реакции. Во время реакции мутагенных праймеров, несущих мутации в желаемой форме не соответствует исходному плазмиды, интегрированы во вновь синтезированных плазмиды. После удаления оригинального плазмиды из реакционной мутировал плазмиды преобразуется в E. палочки. следующие шаги для целей скрининга только потому, что мутация эффективность этого метода не на 100%. Вся процедура занимает три дня, но основная часть может быть сделано в течение одного дня.
1,0 день:
1,1 термоциклирования реакции:
Оригинальные плазмиды: Этот сайт направленного мутагенеза протокол работает лучше всего с помощью плазмидов до 10kb. Большие Плазмиды немного трудно мутировать с помощью этого метода и, возможно, потребуется некоторое терпение и наладка термоциклирования условий и / или компетентных клеток. Кроме того плазмиды которой вы работаете с должна быть изолирована от плотины + бактерий штамма. Для термоциклирования реакции необходимо от 10 до 60 NGS из плазмиды вы хотите мутировать.
Грунтовки: Прежде чем вы сможете настроить термоциклирования реакции вы должны иметь ваш грунтовки под рукой. Вам потребуется около 150 нг каждого мутагенного грунт. Это нормально, если вы берете 1,5 мкл разбавленного 1:10 100 PM акций. Есть несколько простых правил, вы должны учесть при разработке мутагенных праймеров:
- Грунтовки должны дополнять друг друга
- Грунтовки должна быть от 25 до 45 нуклеотидов в длину
- Мутации в виде несоответствия к оригиналу плазмиды должны содержаться в обоих праймеров
- Несоответствия должны быть сосредоточены в грунтовку и в окружении не менее 8 нуклеотидов с каждой стороны
- Грунтовки должны иметь GC-содержания не менее 40%
- Грунтовки должен закончиться 5 премьер и 3 простых с одним или несколькими Gs или Cs
- Грунтовки не должны быть фосфорилированных, и они не должны быть FPLC или страницы очищены, просто обессоленной они должны быть.
- Для расчета Tm вам не нужны никакие формулы, но Tm на доставку сертификат должен быть выше 60 ° C.
- В целях отбора целесообразно вставлять и удалять сайт рестрикции с мутацией. Из-за дегенерации генетического кода Есть много возможностей, чтобы вставить сайт рестрикции с желаемым мутации. На сайте New England Biolabs предоставляет инструмент для поиска таких подходящее место ограничение. Просто введите ваш грунтовки последовательность, кодирующую последовательность аминокислот вы хотите, используя двусмысленности код ДНК. Инструмент фермента поиска покажет вам, какие сайты рестрикции могут быть введены параллельно желаемые мутации. Если вы не можете найти любые возможные ограничения или практические сайта таким образом, вы можете вставить любой новый сайт рестрикции, не о генетическом коде на месте мутации. После этого вы можете воспользоваться этой плазмиды в качестве шаблона для серии мутаций, в которой это ограничение сайт будет удален введения нового мутагенных праймеров. Этот подход может быть очень удобно, если вы планируете сделать ряд мутаций в том же месте из плазмиды.
ДНК-полимеразы: Для этого метода нужно термостабильных ДНК-полимераза который проявляет 3'-5 'экзонуклеазная активность и создает тупыми концами. Мы всегда используем рекомбинантный Pfu-полимераза из Fermentas. Если у вас есть проблемы с усилением шаги, которые вы можете попробовать более высокого качества полимеразы, но для большинства целей стандартные Pfu будет достаточно. Полное реакции с дНТФ, буферные полимеразы и воды.
1,2 термоциклирования условиях
Амплификаторе должны быть установлены следующим образом. Начальные и текущие денатурации фазе установлен в 30 секунд при температуре 95 ° C.
Температуры отжига праймеров не должны рассчитываться со сложными формулами. Мы обычно устанавливается температуры отжига до 55 ° С и времени отжига до одной минуты. Для грунтовки от 25 до 30 нуклеотидов, которые вы будете использовать в основном, это работает для нас 95% времени. Во всяком случае, если это не должно работать, просто попробуйте различной температуры отжига от 50 - до 60 ° C.
Удлинение температура зависит от полимеразы вы используете. В этой демонстрации мы используем Pfu-полимераза из Fermentas, которая призывает к удлинению температуре 72 ° C. Удлинение времени варьируется в зависимости от размера плазмиды. Мы всегда расчета 1 мин в кб, и добавить одну дополнительную минуту, чтовремя. Например, для 9kb плазмиды мы выбрали бы 10 минут, как удлинение времени.
18 циклов достаточно, чтобы создать достаточно мутировал плазмиды для дальнейшего использования. Хранение число циклов низкого, а также экономит ваше время.
1,3 Gelcheck после термоциклирования реакции
Успешное усиления должны быть проверены путем проведения электрофореза. Сразу после езда на велосипеде закончилась, нагрузка 5 мкл реакции на 1% гель ТАЕ агарозном. Если усиление прошла успешно, вы увидите различные группы. Однако, если вновь синтезированной ДНК не ясно видны на гель, вы можете попробовать осадок всей реакции, и использовать его для преобразования в следующий шаг. Для нас это редко работал, но стоит дать попробовать. Лучше всего сделать, если реакции не работа для регулировки температуры отжига.
1,4 ДПНИ пищеварения:
До преобразования оригинального плазмиды которые служили в качестве шаблона должны быть удалены из реакции, чтобы предотвратить сильный фон. Это делается путем рестрикцией с ДПНИ. Это рестриктазы льготы только метилированных плазмиды. Его признание и ограничение сайт последовательность GATC в то время как должен быть метилированию. При переваривании с ДПНИ только оригинальные немутированного плазмиду, которая была изолирована от плотины + штамм получает вырезать, вновь синтезированных мутировал плазмиды, которая не метилированный не зависит от ДПНИ. Просто добавьте 1-2 мкл ДПНИ к реакции и инкубировать ее по меньшей мере одного часа при 37 °. При использовании быстрого переварить ДПНИ инкубационный период может быть сокращен до 15 минут. Качество вашей ДПНИ и времени инкубации это ограничение пищеварения во многом определяет, насколько сильна ваша фон с немутированного плазмиды будет.
1,5 трансформации:
После переваривания ДПНИ плазмиды готова к превращению в компетентный E. кишечной клетки. Просто добавьте 5 мкл из реакционной пищеварения ДПНИ в компетентные клетки и осуществляют преобразования в соответствии с рекомендациями в вашей лаборатории. В нашем случае мы используем процедуру теплового шока путем инкубации бактерий плазмиды смеси на льду в течение 30 мин и затем теплового шока его на 42 ° С в течение 90 сек. После добавления 200 мкл SOC-решения, бактерий инкубируют, энергично встряхивая, при 37 ° С в течение 1 ч. Через 1 час бактерии высевают на агар выборе средств массовой информации.
2,0 День второй
2,1 Скрининг клонов часть 1: Отбор клонов
Поскольку мутации эффективность не 100% вы должны экран для мутантов. Мы делаем это ограничение пищеварения, в которых мы проверяем на наличие или отсутствие ограничений сайт, который мы добавили или удалили через грунтовку интеграции. Для этого мы обычно забрать восемь колоний и вырастить их в течение ночи с плазмидной ДНК на следующий день.
3,0 День третий
3,1 Скрининг клонов часть 2: Ограничение пищеварения с маркера фермент
На третий день вы выполняете Мини Подготовка и последующее пищеварение ограничения с вашего маркера фермент. На гель вы потом можете увидеть, какая из ваших клонов осуществлять желаемые мутации, а какие нет.
Скрининга методом с использованием рестрикцией работает очень хорошо. Тем не менее, вы должны подтвердить свой успешных мутаций путем секвенирования.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Сайт направленного мутагенеза является мутагенеза-метод, который обеспечивает быстрый способ мутировать гена несут плазмиды. Всей реакции можно сделать в один день. С помощью этого метода, он должен лишь пару бесплатный грунтовки проведения желаемых мутаций и корректура, такие как полимеразная Pfu-полимеразы. Вновь синтезированных плазмиды могут быть отделены от родительских плазмид путем переваривания реакцию с ферментом ДПНИ ограничений. Этот фермент дайджесты только метилированную ДНК. Поэтому только вновь синтезированных плазмиды могут быть преобразованы. В этом уроке мы продемонстрировали выполнение сайт направленного мутагенеза с помощью домашнего комплекта мутагенеза. Преимущество этого комплекта экономия в то время как эффективность остается. Критические точки этого метода дизайн грунтовки и температуры отжига. В случае, если вновь синтезированной ДНК не могут быть визуализированы после электрофореза, что может свидетельствовать провал метод, можно попытаться осадок всей реакции, и использовать его для трансформации у бактерий. Однако лучший способ решить эту проблему пытается оптимизировать температуры отжига или увеличить длину постоянной региона в праймеров. Далее, используя высокое качество полимеразы или ограничение фермента может также улучшить чувствительность реакции. Компетентные клетки также являются ключевым фактором, который влияет на успешность этого метода. Поэтому средний (107 КОЕ / мкг ДНК) или высокой (109 КОЕ / мкг ДНК) компетентных клеток являются более предпочтительными.
Хотя в этом уроке мы не продемонстрировали удаления или вставки с помощью домашнего комплекта, нам удалось сделать это в нашей лаборатории. Нам удалось успешно заменить, вставить или удалить по крайней мере 3 баз одновременно.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pfu polymerase (recombinant or native) | Fermentas | EP0571 or EP0501 | |
| dNTP mix 10 mM | Fermentas | R0191 | |
| DpnI or DpnI Fast digest | Fermentas | ER1701 | |
| primers | Invitrogen | desalted |
References
- Papworth, C., Bauer, J. C., Braman, J., Wright, D. A. QuikChange site-directed mutagenesis. Strategies. 9, 3-4 (1996).
