Summary
我々は内部全反射し、落射蛍光顕微鏡を用いて培養アストロサイトにおける膜とグローバルな細胞内カルシウム動態の近くで測定する方法について説明します。
Abstract
脳は、グリア細胞が含まれています。アストロサイト、グリア細胞の種類は、神経細胞に受動的な支援する役割を提供するために長い間知られている。しかし、増加する証拠は、アストロサイトはまた、積極的に神経細胞との機能的な相互作用を介して脳機能に関与する可能性を示唆している。しかし、アストロサイト生物学の多くの基本的な側面は、議論の不明確及び/または実験的に未踏のまま。重要な問題の1つは、アストロサイトにおける細胞内カルシウムトランジェントのダイナミクスである。カルシウムが十分に重要なセカンドメッセンジャーとして確立されているため、それがアストロサイトのカルシウムの上昇は、アストロサイトからの伝達物質の遊離を引き起こすことができることが提案されているので、これは関連しています。しかし、アストロサイトのシグナル伝達の近くに、細胞膜のカルシウムの任意の詳細や満足な説明がされていません。全内部反射蛍光（全反射）顕微鏡は、生きた細胞の原形質膜の約100nm内で生理学的に関連するシグナル伝達事象を分析するための強力なツールです。ここでは、全反射顕微鏡を使用し、ほぼ同時に形質膜とグローバルな細胞内カルシウム動態の近くに監視する方法について説明します。このアプローチのさらなる改良と体系的なアプリケーションは、アストロサイトのカルシウムシグナル伝達の正確な詳細をお知らせする可能性があります。アストロサイトのカルシウム動態の詳細な理解は、次の場合に、どのように、いつ、なぜアストロサイトとニューロンはカルシウム依存性の機能的相互作用を受ける理解する基礎を提供することがあります。
Protocol
実験手順
実験手順は以下のステップ賢明な方法で説明されている2つのキーの部分で構成されています。
パート1：はPREPARING海馬アストロサイトの培養
簡単に言えば、混合海馬アストロサイトニューロン培養物を、十分に確立されたプロトコル1,2,3を用いて調製した。我々は、健全な培養アストロサイトを生成する手順を最適化。以下に記載されているすべての手順は、このような層流フードのような無菌環境で実施されるべきである。
準備カバースリップ
- 22 mmのカバースリップ（VWR、48380〜068）
- ポリ- D -リシン（PDL、シグマP0899）、アリコート（1 mg / ml）を
- ラミニンアリコート（20μg/ ml）を1 mg / mlのラミニン溶液（シグマL2020）に滅菌水49 mlを追加し、-20℃、1.2 mlのアリコートとストアを行う
- （50μg/ ml）を滅菌水でPDLを溶かす
- カバーグラスをオートクレーブ、PDLの滅菌水と場所（100カバースリップ用20 ml）ですすいでください。室温で一晩おきます。
- 滅菌水（3広範な洗浄）とPDLを交換してください。その後、4でカバーガラスと店舗℃を乾燥させる
- アストロサイトをメッキ前日、場所6ウェルプレート（バイオサイエンスBDから滅菌蓋、とウェルフラットボトムプレート）上で無菌ウェル中の個々のカバースリップ。各カバースリップ上ラミニンの400μlを入れ、蒸発を避けるために、インキュベーターで、一晩インキュベートする。
解剖
解剖のメディア：
- 500ミリリットルアールの平衡塩類溶液（EBSS）（1X）、液体（Invitrogen社、14155〜063）
- 5ミリリットルHEPES溶液（Sigma、H0887）
海馬メディア：
- 412.5ミリリットル最小必須培地（MEM）（1X）、液体はアールの塩類が含まれていますが、ないL -グルタミンまたはフェノールレッド（Invitrogen社、51200〜038）
- 10 mlのグルコース（Sigma社、D -（+） - グルコース無水物SIGMA ULTRA G7528）MEMで1 M
- 5ミリリットルペニシリン - ストレプトマイシン（Invitrogen社、15140〜122）
- 5 mlのピルビン酸ナトリウム溶液（Sigma社、S8636）
- 12.5ミリリットルHEPES溶液1 M（シグマ、H0887）
- 5ミリリットルN - 2サプリメント（100X）、液体（Invitrogen社、17502〜048）
- 50ミリリットルウマ血清、熱不活化（Invitrogen社、26050〜088）
パパインのソリューション：
- ワーシントンパパイン- 022バイアル（LK003178、最終濃度が20 U / ml）に解剖メディアの5 mlを加え37℃で60分間℃でインキュベートする。
- P1（通常は2匹）の国内規制及び最寄りの動物実験使用の委員会で吟味し、承認されたガイドラインに従って、老化ラットの仔を刎ねる。
- コールド解剖メディアで満たされたペトリ皿で皮膚と頭蓋骨と場所の脳を取り外します。
- 髄膜を除去、両半球を細かく分析し、海馬を解剖。
- 37パパイン溶液中で〜1X1 mmの片とダイジェスト℃で11〜13分間に海馬を切る。
- 組織片が定着したら、慎重にパパイン酵素の痕跡をすべて削除するには、海馬培地5mlを追加削除します。海馬培地（2ml）中のこのステップを再懸濁しますを繰り返します。
- 徐々に小さく穴（1000μmの、〜500μmおよび〜300μm以下）の三火炎研磨ピペットで残って塊が、なくなるまで細胞〜5回をひいて粉にする。
- 一度粉砕し、セルストレーナー（孔径、70ミクロン、BDバイオサイエンス社）を介して細胞を通過する。懸濁液10μlに細胞を数える。 40万細胞/ mlを持つために、海馬のメディアの音量を調整します。
- カバースリップオフラミニンを吸引し、カバースリップあたりの細胞懸濁液のカバーが乾燥する前に、プレートを200μl。
- インキュベーター内で60分間添付し、ウェルあたり海馬培地2mlを追加するためにそれらを残す。
- 翌日、死んだ細胞や破片を除去し、予め温めておいた新鮮な海馬培地2mlを追加するには、古い海馬の培地を吸引除去する。
メンテナンス
Neurobasalメディア：
- 500ミリリットルneurobasal（Invitrogen社、12348〜017）
- 10ミリリットルB27の無血清サプリメント（Invitrogen社、17504〜044）
- 5ミリリットルペニシリン - ストレプトマイシン（Invitrogen社、15140〜122）
- 1.25ミリリットル、L -グルタミン（Invitrogen社、25030〜149）
メッキ後4日から始まる、neurobasal培地でアストロサイトニューロンの培養週に2回通します。温度とCO 2を平衡化するために換気フラスコ内のインキュベーターで30分程度のメディアをPreincubate。
パート2：カルシウムイメージング
海馬レコーディングバッファ：110 mMのNaCl、5.4 mMののKCl、1.8 mMのCaCl 2を 、0.8 mMのMgCl 2、10mMのD -グルコース、10mMのHEPES（シグマからすべての化学物質）を用いてpH 7.4（NaOHで調整）。
アストロサイトへのカルシウム指示薬のロード
- （Invitrogen社、DMSOは2.5μMであるFluo - 4、AM（Invitrogen社、F - 14217）と、0.05％プルロニック® F - 127 20％溶液の入った2ミリリットル海馬記録バッファーを充填した6ウェルプレートにウェルに文化を置きますP - 3000MP）と,10 - 30分間室温でインキュベートする。
- であるFluo - 4ソリューションを削除し、30分間室温で海馬の記録バッファとインキュベートしてカバーグラスを3回洗浄。
- チャンバーにカバースリップを置き、レンズクリーニング液でカバースリップの反対側を清掃してください。
- 客観的に液浸オイルの一つの小さな滴（Cargilleから液浸オイルタイプのDFを）入れて、顕微鏡のステージ（オリンパスIX71）にチャンバー（ワーナー音源から25 mmの円形のカバーのオープンチャンバー）を置く。
- 細胞がどのように見えるかを確認し、フォーカスにそれらを得るために透過光を用いて細胞を調べます。その後モノクロから488 nmの（ビジョンTILLからポリクロームV）で細胞を照らすとみたFluo - 4の蛍光シグナルがアストロサイトで均一と検出可能であるかどうかを判断する。
- アストロサイトのカルシウムを測定するために、EPIと全反射照明を使用してください。
全反射顕微鏡
簡単に言えば、我々は、アンドールIXON DV887DCS EMCCDカメラを搭載したオリンパスIX71顕微鏡を使用してください。励起と画像取得の制御は、TILLVisionのソフトウェアを使用して実現されます。 454/488/515 nmのアルゴン（100 mWの）および442 nmの固体状態（45 MW）レーザのビームを組み合わせて使用して制御されるまで、ポリラインレーザーコンバイナ、TIRFデュアルポートのコンデンサーとacoustopticalチューナブルフィルタとコントローラ（AOTF;すべてからフォトニクスTILL）と全反射のコンデンサーに入るためKineflex広帯域光ファイバに供給。我々は、全反射を達成するためにオリンパス60X 1.45 NAのレンズを使用。カメラのゲインは、ノイズ画像に最適な信号を提供するために、それぞれの星状膠細胞に調整されます。背景と全反射顕微鏡の原理は、最近、5日している。我々が使用する光学部品のほとんどは、今アジレントテクノロジー（http://www.till-photonics.com/）の一部であるフォトニクス、TILLから購入した。 TIRの侵入深さは次式から計算することができます。
D =侵入深さ
ガラスのN1 =屈折率
セルのN2 =屈折率
発生率の=角
発生率のNAI =開口数
レーザーは全反射のために最適に整列されていることを確認するために我々は100nmの蛍光ビーズ（Invitrogen社、F8803）を観察すると便利です。我々は、EPIと全反射顕微鏡でビーズの静止フレームとビデオを提示する。ときに全反射で、一つは信号対雑音の劇的な増加を観察し、ビーズはブラウン拡散が表示されます。我々は最適な全反射ではなく、臨界角に等しいではなかった場合に発生する危険にさらさ斜入射照明ではなく、発生したことを確認するために、定期的に全反射顕微鏡と100 nmのビーズ（〜週1回）の挙動を観察すると便利ですα（図1参照）。
G蛋白質共役型受容体アゴニストのアプリケーション
アストロサイトは、代謝型グルタミン酸受容体とP2Y受容体（アゴニスト、ATP、ADP）を含むGQ -共役受容体6,7の様々な表現。これらの受容体の活性化は、星状膠細胞内細胞内カルシウムレベルの大幅な増加につながる。例えば、人は容易にアストロ8-10にATP（30μM）の適用時に細胞内カルシウムの上昇を観察することができます。我々はワーナー音源からのスイッチャーは、VC - 77SPファーストステップ灌流システム（http://www.warneronline.com/index.cfm）と呼ばれる高速なソリューションを使用してください。この方法では解決策は以下〜10ミリ秒未満に適用することができます。
図1漫画やイメージングの写真は、設定する。 （B）レーザーアセンブリ、コントローラとビームボックスの写真を示すのに対し、A.は、airtableにマウントされている顕微鏡の写真を表示します。 C.は、イメージングのためにマウントされているチャンバーと顕微鏡のステージの写真を表示します。左の高速灌流装置（ステッピングモーターとシータのチューブと一緒に）見ることができます。右上Axopatch 200Aアンプのヘッドステージが見られる。漫画はセット内の光パスをschematizesとどのようにTIRFが達成されます。レーザーは、60X 1.45 NAの対物レンズの後焦点面に焦点を当てて、それが臨界角をαでイマージョンオイルに出てくるようにその位置がセンターをオフに調整されます。この時点で、ビームは、より低い屈折率の媒質中に距離λ（メインテキストの式を参照）で内部全反射と減衰に苦しんでいる。この場合、これはアストロサイトとアストロサイト自身を取り巻く録音バッファです。結果は、形質膜の〜100nmの内の分子の光学的励起（したがって画像）です。細胞内や細胞の上部表面上のものが励起されていないのに対し、細胞の漫画では、これは、緑色の"興奮"膜受容体として示されています。全反射顕微鏡の完全なアカウントはSteyerとAlmers 4で提供されています。
図2。EPIと全反射顕微鏡で取得した100nmの蛍光ビーズの画像。 A.は、数十100nmの蛍光ビーズと視野のEPI画像を表示します。青い矢印は水の拡散であるビーズを指すのに対し、ガラスのカバースリップの上に定住しているビーズに赤い矢印のポイント。このビューではAに示すようにB.は赤い矢印で示される接着ビーズが表示されるビューの同じフィールドの全反射画像を表示します。これらはガラスのcoverlsipに定住し、〜100nmのエバネッセント場内でこのようにしたしていたためです。青色の矢印でに示されているビーズは、この領域内にないため、全反射の画像では見えません。下のプロットは、画像の3Dレンダリングを示しています。それは、全反射顕微鏡で観察すると、信号対ノイズの大幅な増加は、エバネッセント場内のビーズのために起こることは明らかである。全反射のためにそれが20であったのに対し± 0.7実際にはこれらのイメージのためにEPIのための信号対雑音比は、7.1 ± 0.6であった。
図3。EPIと全反射顕微鏡で取得したフルオ-4カルシウム指示薬を搭載したアストロサイトの画像。 fiveアストロサイトとビューのフィールドのA. EPI画像。 AとBのイメージが大きく異なることをBに示すように、B.ビューの同じフィールドの全反射像は注意してください。 TIRF照明とガラスのカバースリップに近い同格でのみ細胞膜領域がイメージングされているためです。下のパネルでは、EPIと全反射顕微鏡で撮像ATP誘発細胞内カルシウムトランジェントを示しています。
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Discussion
それは、アストロサイトは細胞内カルシウムの上昇を表示することが十分に確立されている。これらは自発的に発生する、アストロサイト表面11上の受容体を活性化するニューロンの活動によって、またはアゴニストのアプリケーションによってトリガーすることができます。一つの重要なと論争はアストロサイト細胞内カルシウムの上昇が神経細胞11、12に受容体を活性化するシグナル伝達分子の放出を引き起こすことができるかどうかです。としてヘイドン7、13とマッカーシー11ラボによるレビューで強調表示されているこのビューのと反対の証拠が、あったので、これは物議を醸している。我々の最近の脳スライスイメージングと電気生理学的データに基づいて、我々は新たな仮説駆動型の実験はどのようにアストロサイトの影響のニューロン14を決定するように設計することができます前に、アストロサイトのカルシウム動態の向上と正確な理解が必要であると主張した。このビデオの記事では、形質膜と培養アストロサイトにおけるほぼ同時に世界的な細胞内カルシウムの変化に近い画像に簡単な方法を提示する。全反射顕微鏡の避けられない技術的な要件は、エバネッセント場の深さ3内にガラスのカバースリップに付着するため、培養細胞を使用する必要があることです。それは文化の中で星状膠細胞がin vivo 15のそれらと比較すると、それらの遺伝子発現プロファイルを変更し、このメソッドを実装するときので、この警告を考慮する必要があることは注目に値する。しかし、これを念頭に考慮して我々が報告する簡単な方法は、イメージに1つを許可していないとほぼ同時に、原形質膜とグローバルな細胞内カルシウム変化の近くに定量化する。アストロサイトへのアプローチの更なる応用は、アストロサイトの形質膜に近い細胞内カルシウムの変化に正確なデータを提供することの可能性を秘めています。このような定量的なデータの可用性は、アストロサイト生物学の完全な理解のために有用であろう。
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Acknowledgments
この作品は、日本の財団法人上原記念生命科学財団（ESの）だけでなく、ホワイトホール財団、神経疾患や脳卒中の国立研究所とスタインハイマー基金賞（BSKまで）によってサポートされていました。
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| VWR® Micro Cover Slips, Round, No. 1 | Tool | VWR international | 48380-068 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Reagent | Sigma-Aldrich | P0899 | |
| Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane | Reagent | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| Earle’s Balanced Salt Solution (EBSS) (1X), liquid | Reagent | Invitrogen | 14155-063 | |
| Minimum Essential Medium (MEM) (1X), liquid Contains Earle’s salts, but no L-glutamine or phenol red | Reagent | Invitrogen | 51200-038 | |
| Penicillin-Streptomycin liquid | Reagent | Invitrogen | 15140-122 | |
| Sodium pyruvate solution | Reagent | Sigma-Aldrich | S8636 | |
| HEPES solution 1 M | Reagent | Sigma-Aldrich | H0887 | |
| N-2 Supplement (100X), liquid | Reagent | Invitrogen | 17502-048 | |
| Horse Serum, Heat-Inactivated | Reagent | Invitrogen | 26050-088 | |
| PAPAIN-022 | Reagent | Worthington Biochemical | LK003178 | |
| Neurobasal™ Medium (1X) Liquid without Phenol Red | Reagent | Invitrogen | 12348-017 | |
| B-27 Serum-Free Supplement (50X), liquid | Reagent | Invitrogen | 17504-044 | |
| L-Glutamine-200 mM (100X), liquid | Reagent | Invitrogen | 25030-149 | |
| Cell Strainers | Tool | BD Biosciences | 352350 | |
| BD Falcon Multiwell Flat-Bottom Plates with Lids, Sterile | Tool | BD Biosciences | 353046 | |
| NaCl | Reagent | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| KCl | Reagent | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| CaCl2 hexahydrate | Reagent | Sigma-Aldrich | 21108 | |
| MgCl2 hexahydrate | Reagent | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| HEPES free acid | Reagent | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| D-(+)-glucose | Reagent | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| Fluo-4, AM 1 mM solution in DMSO | Reagent | Invitrogen | F-14217 | |
| Pluronic® F-127 20% solution in DMSO | Reagent | Invitrogen | P-3000MP | |
| Immersion Oil TYPE DF | Microscope | Cargill Labs | 16242 | |
| Open chamber for 25 mm round coverslips, 100 μl volume | Tool | Warner Instruments | 64-0362 (RC-21BDW) | |
| P-2 platform for Series 20 chambers, non-heater | Tool | Warner Instruments | 64-0278 (P-2) | |
| FluoSpheres carboxylate-modified microspheres, 0.1 μm, yellow-green fluorescent (505/515) 2% solids | Reagent | Invitrogen | F8803 |
References
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