Summary
우리는 총 내부 반사와 epifluorescence 현미경을 사용하여 교양 astrocytes에 막 및 글로벌 세포내 칼슘 역학 근처 측정하는 방법에 대해 설명합니다.
Abstract
두뇌는 glial 세포가 포함되어 있습니다. Astrocytes, glial 세포의 종류는 긴 뉴런에 수동 지원 역할을 제공하는 것으로 알려져 있습니다. 그러나, 증가 증거 astrocytes도 적극적으로 뉴런과 기능적 상호 작용을 통해 뇌의 기능에 참여할 수있다하는 것이 좋습니다. 그러나, astrocyte 생물학의 많은 근본적인 측면 논쟁, 불분명 및 / 또는 실험적으로 미개척 남아있다. 중요한 문제는 astrocytes의 세포내 칼슘 과도의 역학입니다. 칼슘이 잘 중요한 두번째 메신저로 설립되고 있기 때문에 그것이 astrocyte 칼슘 고도가 astrocytes에서 송신기의 릴리스를 실행할 수있는 제안 되었기 때문에이 적합합니다. 그러나, astrocytes의 신호 근처 플라즈마 막 칼슘의 자세한 설명을하거나 만족이되지 않았습니다. 총 내부 반사 형광 (TIRF) 현미경 살 세포의 플라즈마 막의 약 100 nm의 시간 생리학 관련 신호 이벤트를 분석하는 강력한 도구입니다. 여기, 우리는 TIRF 현미경을 사용하여 거의 동시에 플라즈마 막과 글로벌 세포내 칼슘 역학 근처 모니터링하는 방법에 대해 설명합니다. 이 방법의 자세한 상세하고 체계적인 응용 프로그램은 astrocyte 칼슘 신호의 정확한 세부 사항에 대해 알리기 위해 가능성이 있습니다. astrocyte 칼슘 역학에 대한 상세한 이해, 어떻게 언제 왜 astrocytes와 뉴런은 칼슘 의존 기능 상호 작용을 거쳐, 이해하는 기초를 제공할 수 있습니다.
Protocol
실험 절차
실험 절차는 다음 단계 현명한 방식으로 설명하는 두 가지 핵심 부분으로 구성됩니다.
1 부 : 준비 HIPPOCAMPAL ASTROCYTE 문화
간단히 혼합 hippocampal astrocyte - 신경 세포의 문화가 잘 설립 프로토콜 1,2,3을 사용하여 준비되었습니다. 우리는 건강 교양 astrocytes를 얻을 수있는 절차를 최적화. 아래에 나열된 모든 절차는 이러한 층류 후드로 멸균 환경에서 수행되어야합니다.
준비 coverslips
- 22mm의 coverslips (VWR, 48380-068)
- 폴리 - D - 라이신 (PDL, 시그마 P0899), aliquots (1 MG / ML)
- Laminin aliquots가 (20 μg / ML) : 1 MG / ML laminin 솔루션 (시그마 L2020)에 멸균 물의 49 ML을 추가, -20 ° C에서 1.2 ML aliquots 및 저장을
- (50 μg / ML) 멸균 물의 PDL을 풀다
- coverslips을 압력솥, PDL의 살균 물과 장소 (100 coverslips 20 ML)로 헹굼. 하룻밤 상온에서 둡니다.
- 멸균 물 (3 광범위한 세척)와 PDL을 바꿉니다. 그런 다음 4 coverslips하고 저장 ° C. 건조
- 6 잘 플레이트 (무균 Bioscience BD의 뚜껑과 Multiwell는 플랫 - 바텀 플레이트)에 대한 살균 잘에 astrocytes, 장소 개별 coverslips을 도금 전날. 각 coverslip에 laminin 400 μl를 넣고 증발을 방지하기 위해 인큐베이터에서 밤새 품어.
해부
해부 미디어 :
- 500 ML 얼의 밸런스드 소금 솔루션 (EBSS) (1X), 액체 (Invitrogen, 14155-063)
- 5 ML HEPES 용액 (시그마, H0887)
Hippocampal 미디어 :
- 412.5 ML 최소 필수 중간 (멤) (1X)은 액체가 얼의 염분을 포함하지만 L - 글루타민 또는 페놀 레드 없음 (Invitrogen, 51200-038)
- 10 ML 포도당 (시그마, D - (+) - 포도당 무수 시그마 ULTRA G7528) 멤 1 M
- 5 ML 페니실린 - 스트렙토 마이신 (Invitrogen, 15140-122)
- 5 ML 나트륨 pyruvate 솔루션 (시그마, S8636)
- 12.5 ML HEPES 용액 1 M (시그마, H0887)
- 5 ML N - 2 보충 (100X), 액체 (Invitrogen, 17502-048)
- 50 ML 호스 세럼, 열 Inactivated (Invitrogen, 26050-088)
Papain 솔루션 :
- 워싱턴 PAPAIN - 022 유리병 (LK003178, 최종 농도가 20 U / ML)로 해부 미디어의 5 ML 추가 37 60 분 ° C 품어.
- P1 (일반적으로이 새끼) 국가 규정 및 지역 기관 애니멀 케어 및 사용위원회 vetted 및 승인 지침에 따라 세 쥐 새끼 목을 벨.
- 감기 해부 미디어 가득 배양 접시에있는 피부와 두개골과 장소의 두뇌를 제거합니다.
- meninges을 제거, 두 반구를 해부하다하고 hippocampi을 해부하다.
- 37 papain 솔루션 ~ 1X1 mm 조각 소화 ° C 11-13 분에 hippocampi 잘라.
- 조직의 조각이 정착되면, 제거 신중하게 papain과 효소의 모든 흔적을 제거하는 hippocampal 매체의 5 ML를 추가합니다. hippocampal 매체 (2 ML)에서이 단계와 resuspend를 반복합니다.
- 점차적으로 더 작은 한거죠 (1000 μm의 ~ 500 μm의와 ~ 300 μm의)의 세 불꽃 - 광택 pipettes로 남아 대단히 짧은 시간은 없습니다 때까지 세포 ~ 5 번 씹다.
- 일단 triturated, 셀 스트레이너 (기공 크기, 70 μm의, BD Bioscience)를 통해 세포를 전달합니다. 정지 10 μl의 세포를 계산합니다. 400000 세포 / ML을 위해 hippocampal 매체의 볼륨을 조정합니다.
- coverslips에서 laminin을 기음과 coverslip 당 세포 현탁액의 표지가 건조하기 전에 판 200 μl.
- 그들이 인큐베이터에서 60 분 부착 후 잘 당 hippocampal 중간 2 ML을 추가할 수 둡니다.
- 다음 날, 죽은 세포와 찌꺼기를 제거하고 미리 예열 신선한 hippocampal 중간 2 ML을 추가하려면 이전 hippocampal 매체를 대기음.
유지
Neurobasal 미디어 :
- 500 ML neurobasal (Invitrogen, 12348-017)
- 10 ML B27 혈청 무료 보충 (Invitrogen, 17504-044)
- 5 ML 페니실린 - 스트렙토 마이신 (Invitrogen, 15140-122)
- 1.25 ML L - 글루타민 (Invitrogen, 25030-149)
도금 후 사일 시작 neurobasal 매체와 astrocyte - 뉴런 문화 일주일에 두 번 먹이. 온도와 CO 2를 평형에 통풍이 플라스크에 인큐베이터에서 30 분 대한 미디어 Preincubate.
2 부 : 칼슘 이미징
Hippocampal 레코딩 버퍼 : 110 MM NaCl, 5.4 MMKCl, 1.8 MM CaCl 2, MgCl 2 0.8 MM 10 MM D - 글루코오스, 10 MM HEPES (시그마의 모든 화학 물질) 산도 7.4 (NaOH로 조정).
astrocytes에 칼슘 지표 염료를 로딩
- (Invitrogen, DMSO 2.5 μm의 Fluo - 4 AM (Invitrogen, F - 14217)와 0.05 %의 Pluronic ® F - 127 20 % 용액을 포함하는 두 ML hippocampal 기록 버퍼로 가득한 6 잘 접시에 잘있는 문화 플레이스 P - 3000MP)와 10-30 분 실온에서 알을 품다.
- Fluo - 4 솔루션을 제거하고 30 분 실온에서 hippocampal 기록 버퍼와 부화와 coverslips에게 3 회 씻는다.
- 챔버에 coverslip를 삽입하고, 렌즈 클리닝 액체로 coverslip의 다른 측면을 청소.
- 목적에 침지 기름의 작은 방울 (Cargille에서 집중 오일 종류 DF)를 넣고 현미경의 무대 (올림푸스 IX71)에 실 (워너 인스 트루먼 트에서 25mm의 원형 coverslip에 대한 열기 챔버)을 넣어.
- 세포가 보이는지, 그리고 초점에 그들을 위해 전송 라이트를 사용하여 세포보세요. 다음 (비전까지에서 폴리 크롬 V) 단색에서 488 nm의와 세포를 조명하고 Fluo - 4의 형광 신호가 균일하고 astrocytes에 감지할 수 있는지 확인합니다.
- astrocytes에 칼슘을 측정하는 에피네프린과 TIRF 조명을 사용합니다.
TIRF 현미경
간단히, 우리는 Andor IXON DV887DCS EMCCD 카메라가 장착된 올림푸스 현미경 IX71을 사용합니다. 여기 및 이미지 수집의 제어 TILLVision 소프트웨어를 사용하여 이루어진다. 454/488/515 nm의 아르곤 (100 MW)와 442 nm의 고체 (45 MW) 레이저의 광선이 결합과 함께 제어까지 폴리 라인 레이저 결합기, TIRF 듀얼 포트 콘덴서와 acoustoptical tuneable 필터와 컨트롤러 (AOTF, 모든의 TIRF의 콘덴서에 입국 Kineflex 넓은 밴드 섬유로 Photonics) 및 공급 때까지. 우리는 TIRF를 달성하는 올림푸스 60X 1.45 NA 렌즈를 사용합니다. 카메라 이득은 노이즈 이미지를 최상의 신호를 제공하는 각 astrocyte에 대해 조정됩니다. 배경 및 TIRF 현미경의 원리는 최근 5 4을 검토하고 있습니다. 우리가 사용하는 광학 부품의 대부분은 이제 애질런트 테크놀 로지스 (http://www.till-photonics.com/)의 일부 Photonics,까지에서 구입한했다. 티르의 침투 깊이는 아래의 방정식으로부터 계산하실 수 있습니다.
D = 침투 깊이
유리 N1 =의 굴절률
세포의 N2 = 굴절률
발병률의 A = 각도
발병률의 나이 = 숫자 조리개
레이저가 TIRF을위한 최적의 정렬되도록하기 위해 우리는 100 nm의 형광 구슬 (Invitrogen, F8803)를 준수하는 것이 유용할. 우리는 여전히 프레임과 에피와 TIRF 현미경과 구슬의 동영상을 제시한다. TIRF 경우에, 하나는 신호 대 잡음의 극적인 증가를 관찰하고 구슬이 Brownian 확산을 표시합니다. 중요한 각도가 동일하지 않다면 우리는 최적의 TIRF 오히려 발생할 위험 경사 조명보다 발생 있는지 확인하기 위해 정기적으로 (~ 한 주당)에 TIRF 현미경 100 nm의 비즈의 행동을 관찰하는 것이 유용 α (그림 1 참조).
G - 단백질 결합 수용체 agonists의 응용
Astrocytes는 metabotropic 글루 탐 산염 수용체와 P2Y 수용체 (작용제, ATP, ADP)를 포함 GQ - 결합 수용체 6, 7의 다양한 표현한다. 이들 수용체의 활성화는 astrocytes 이내 세포 내 칼슘 수준에서 크게 증가 발생합니다. 예를 들어, 하나는 쉽게 astrocytes의 80-10에 ATP (30 μm의)의 응용 프로그램을하는 동안 세포 내 칼슘의 고도를 볼 수 있습니다. 우리는 워너 인스 트루먼 트에서 스위처는 VC - 77SP 빠른 단계 재관류 시스템 (http://www.warneronline.com/index.cfm를)라는 빠른 솔루션을 사용합니다. 이 방법 솔루션은 ~ 10 MS 이하에 적용할 수로.
그림 1. 만화와 영상의 사진가 설정할 수 있습니다. (B) 레이저 어셈블리, 컨트롤러 및 빔 상자의 사진을 보여주는 반면 A.는 airtable에 장착된 현미경의 사진을 보여줍니다. C.이 영상에 대한 마운트 챔버와 함께 현미경 단계의 사진을 보여줍니다. 에 빠른 재관류 장치 (스테퍼 모터와 세타 튜브와 함께)을 볼 수 있습니다 떠났다. 오른쪽 Axopatch 200A 증폭기의 headstage 볼 수 있습니다. 만화는 세트에서 빛을 경로를 schematizes 어떻게 TIRF가 이루어집니다. 레이저는 그것이 중요한 각도 α에 침지 기름에 나온다 있도록 중심을 조정하는 60X 1.45 NA 목표 렌즈와 위치의 뒤쪽 초점 비행기에 초점을두고 있습니다. 이 시점에서 빔 낮은 굴절률의 중간에 거리 λ (주 텍스트로 방정식을 참조) 총 내부 반사와 자연 붕괴로 인해 고통받는. 이 경우에 이것은 astrocytes 및 astrocytes 자신을 둘러싼 녹음 버퍼입니다. 결과는 플라즈마 막의 ~ 100 nm의 시간 분자의 광학 여기 (때문에 영상)입니다. 세포 내에서 또는 세포의 상단 표면에 사람들이 흥분되지 않은 반면, 세포의 만화는 이것이 녹색 "흥분"막 수용체로 표시됩니다. TIRF 현미경의 전체 계정은 스테 이어와 Almers 사에 의해 제공되었습니다.
그림 2. 에피와 TIRF 현미경과 함께 인수 100 nm의 형광 구슬의 이미지. A. 여러 개 100 nm의 형광 구슬로보기의 필드의 에피 이미지를 표시합니다. 파란 화살촉이 물에 diffusing 아르 구슬을 가리킨 반면, 유리 coverslip에 정착 구슬에 빨간색 화살표 지점. B.는 빨간색 화살표로 표시된 자기편 비즈가 표시되는이보기에서는 A. 같이보기 같은 분야의 TIRF 이미지를 표시합니다. 이들은 유리 coverlsip에 정착하고 ~ 100 nm의 지극히 미미한 분야 내에서 따라서 이었어요 때문입니다. 파란 화살표로 표시 구슬이 지역 내에서되지 않으며 TIRF 이미지에 따라서 보이지 않습니다. 낮은 줄거리는 이미지의 3D 렌더링을 보여줍니다. 그것은 TIRF 현미경으로 관찰하면 신호 대 잡음의 큰 증가가 지극히 미미한 분야 내에서 구슬에 대한 발생 분명하다. TIRF 위해 20되었다 반면 ± 0.7 사실 이러한 이미지에 대한 에피네프린을위한 신호 대 잡음은 7.1 ± 0.6되었다.
그림 3. 에피와 TIRF 현미경과 함께 인수 Fluo - 4 칼슘 표시기 색소와 함께 로드된 이미지 astrocytes. 오 astrocytes 전망이 분야의 A. 에피 이미지. 의 이미지가 A와 B가 크게 다르다는 것을 B. 참고보기에 표시된 것과 같은 분야의 B. TIRF 이미지. TIRF 조명과 유리 coverslip에 가까운 동격에서만 플라즈마 막 지역이 몇 군데 있기 때문입니다. 하단 패널은 표시 ATP - evoked 에피와 TIRF 현미경과 몇 군데 세포내 칼슘 과도합니다.
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Discussion
그것은 astrocytes은 세포 내 칼슘의 고도를 표시 잘 설정됩니다. 이들은 자발적으로 발생하는가의 연결 활동이나 astrocyte 표면 11 수용체를 활성화하기 위해 agonists의 응용 프로그램에 의해 실행하실 수 있습니다. 하나의 중요한 논쟁 문제는 astrocyte 세포 내 칼슘의 고도는 뉴런 11, 12 수용체를 활성화 신호 분자의 릴리스를 실행할 수 있는지 여부입니다. 로 헤이든 7, 13, 11 맥카시 실험실에 의해 리뷰에 강조이보기와에 대한 증거를이 되었기 때문에 이것은 논쟁이다. 우리는 새로운 가설을 기반 실험 방법 astrocytes 충격 뉴런에게 14 결정할 수 있도록 설계하기 전에 astrocyte 칼슘 역학보다 정확한 이해가 필요하다는 주장 최근 뇌의 슬라이스 이미징 및 전기 생리학 데이터를 기반으로. 이 동영상이 문서에서 우리는 플라즈마 막과 교양 astrocytes 거의 동시에 글로벌 세포내 칼슘의 변화 근처 이미지에 간단한 방법을 제시한다. TIRF 현미경의 피할 수없는 기술적 요구 사항들은 지극히 미미한 분야 깊이 3 이내에 유리 coverslip을 준수하기 때문에 교양 세포를 사용해야한다는 것입니다. 그것은 문화의 astrocytes은 생체내 15 사람에 비해 자신의 유전자 발현 프로필을 변경하고이 방법을 구현할 때 주의해야 할 점은 이것이 고려되어야한다는 지적 가치가있다. 그러나 마음이 고려 우리가보고 간단한 방법은 이미지 하나를 허용 않으며 거의 동시에 플라즈마 막과 글로벌 세포내 칼슘의 변화 근처 계량. astrocytes에 대한 접근의 추가 응용 프로그램 astrocytes의 플라즈마 막 근처의 세포 내 칼슘의 변화에 대한 정확한 자료를 제공의 약속을 보유하고 있습니다. 이러한 양적 데이터의 가용성 astrocyte 생물학의 완전한 이해에 도움이 될 것입니다.
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Acknowledgments
이 작품은 일본의 우에하라 기념 재단 (ES)을뿐만 아니라 화이트홀 재단, 신경 장애 및 뇌졸중과 스테인 - 오펜 하이머 엔다우먼트 수상 (BSK)을 국립 연구소에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| VWR® Micro Cover Slips, Round, No. 1 | Tool | VWR international | 48380-068 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Reagent | Sigma-Aldrich | P0899 | |
| Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane | Reagent | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| Earle’s Balanced Salt Solution (EBSS) (1X), liquid | Reagent | Invitrogen | 14155-063 | |
| Minimum Essential Medium (MEM) (1X), liquid Contains Earle’s salts, but no L-glutamine or phenol red | Reagent | Invitrogen | 51200-038 | |
| Penicillin-Streptomycin liquid | Reagent | Invitrogen | 15140-122 | |
| Sodium pyruvate solution | Reagent | Sigma-Aldrich | S8636 | |
| HEPES solution 1 M | Reagent | Sigma-Aldrich | H0887 | |
| N-2 Supplement (100X), liquid | Reagent | Invitrogen | 17502-048 | |
| Horse Serum, Heat-Inactivated | Reagent | Invitrogen | 26050-088 | |
| PAPAIN-022 | Reagent | Worthington Biochemical | LK003178 | |
| Neurobasal™ Medium (1X) Liquid without Phenol Red | Reagent | Invitrogen | 12348-017 | |
| B-27 Serum-Free Supplement (50X), liquid | Reagent | Invitrogen | 17504-044 | |
| L-Glutamine-200 mM (100X), liquid | Reagent | Invitrogen | 25030-149 | |
| Cell Strainers | Tool | BD Biosciences | 352350 | |
| BD Falcon Multiwell Flat-Bottom Plates with Lids, Sterile | Tool | BD Biosciences | 353046 | |
| NaCl | Reagent | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| KCl | Reagent | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| CaCl2 hexahydrate | Reagent | Sigma-Aldrich | 21108 | |
| MgCl2 hexahydrate | Reagent | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| HEPES free acid | Reagent | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| D-(+)-glucose | Reagent | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| Fluo-4, AM 1 mM solution in DMSO | Reagent | Invitrogen | F-14217 | |
| Pluronic® F-127 20% solution in DMSO | Reagent | Invitrogen | P-3000MP | |
| Immersion Oil TYPE DF | Microscope | Cargill Labs | 16242 | |
| Open chamber for 25 mm round coverslips, 100 μl volume | Tool | Warner Instruments | 64-0362 (RC-21BDW) | |
| P-2 platform for Series 20 chambers, non-heater | Tool | Warner Instruments | 64-0278 (P-2) | |
| FluoSpheres carboxylate-modified microspheres, 0.1 μm, yellow-green fluorescent (505/515) 2% solids | Reagent | Invitrogen | F8803 |
References
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