Summary
Biz toplam iç yansıma ve Epifloresans mikroskopi kullanılarak kültürlü astrositler membran ve küresel hücre içi kalsiyum dinamikleri yakın ölçmek için nasıl açıklar.
Abstract
Beyin glial hücreler içerir. Astrositler, glial hücre tipi, uzun nöronlar için pasif bir destekleyici bir rol sağlamak için bilinmektedir. Ancak, artan kanıtlar astrositler nöronlar ile fonksiyonel etkileşim yoluyla da aktif beyin fonksiyonu katılmak olabileceğini düşündürmektedir. Ancak, birçok temel yönleri astrosit biyoloji, tartışmalı, belirsiz ve / veya deneysel keşfedilmemiş kalır. Bir önemli konu astrositlerde hücre içi kalsiyum Transientlerin dinamikleri. Kalsiyum önemli bir ikinci haberci olarak iyi kurulmuş ve çünkü astrosit kalsiyum yükselmeler astrositler gelen vericileri serbest bırakılması tetikleyebilir ileri sürülmektedir çünkü bu geçerlidir. Ancak, yakın plazma membranı kalsiyum astrositler sinyal herhangi bir ayrıntılı ve tatmin edici bir açıklama olmamıştır. Toplam iç yansıma floresan (TIRF) mikroskopi canlı hücrelerinin plazma membranı yaklaşık 100 nm içinde önemli fizyolojik sinyalleme olaylarını analiz etmek için güçlü bir araçtır. Burada, TIRF mikroskobu kullanımı ve neredeyse aynı anda, plazma membranı ve küresel hücre içi kalsiyum dinamikleri yakın izlemek nasıl tarif. Bu yaklaşımın daha rafine ve sistematik bir uygulama astrosit kalsiyum sinyal kesin detaylar hakkında bilgi potansiyeline sahiptir. Astrosit kalsiyum dinamiklerinin ayrıntılı bir anlayış, nasıl, ne zaman ve neden astrositler ve nöron kalsiyum-bağımlı fonksiyonel etkileşimleri tabi anlamak için bir temel sağlayabilir.
Protocol
DENEYSEL PROSEDÜRLER
Deneysel işlemin bir adım daha akıllıca bir şekilde aşağıda açıklanan iki ana bölümden oluşmaktadır.
Bölüm 1: HAZIRLAMA hipokampal astrosit KÜLTÜRLER
Kısaca, karışık, hipokampal astrosit nöron kültürleri iyi kurulmuş bir protokol 1,2,3 kullanılarak hazırlanmıştır. Prosedürü, sağlıklı kültürlü astrositler verim için optimize edilmiş. Aşağıda listelenen tüm işlemler, steril bir ortamda böyle bir laminer akış kaputu gibi yapılmalıdır.
Hazırlanması lamelleri
- 22 mm lamelleri (VWR, 48.380-068)
- Poly-D-Lizin (PDL, Sigma P0899), alikotları (1 mg / ml)
- Laminin alikotları (20 mg / ml): 1 mg / ml laminin solüsyonu (Sigma L2020) ile 49 ml steril su ekleyin, -20 ° C'de 1.2 ml alikotları ve mağaza
- (50 mg / ml) steril su PDL çözülür
- Lamelleri Otoklav, PDL steril su ve yeri (100 lamelleri için 20 ml) ile durulayın. Gece boyunca oda sıcaklığında bekletin.
- PDL steril su ile (3 geniş yıkar) değiştirin. Sonra 4 lamelleri ve mağaza ° C kuru
- 6 plaka (Steril Bioscience BD Kapaklar multiwell Düz Tabanlı Tabaklar) steril bir kuyu astrositler, bireysel lamelleri kaplama bir gün önce. Her lamel laminin ul 400 koyun ve buharlaşmasını önlemek için inkübatör, gece inkübe edin.
Diseksiyon
Diseksiyon medya:
- 500 ml Earle Dengeli Tuz Çözeltisi (EBSS) (1X), sıvı (Invitrogen, 14.155-063)
- 5 ml Hepes solüsyonu (Sigma, H0887)
Hipokampal medya:
- 412,5 ml Minimum Essential Medium (MEM) (1X), sıvı Earle Kullanıcı tuz içerir, ancak hiçbir L-glutamin veya fenol kırmızısı (Invitrogen, 51.200-038)
- 10 ml glikoz (Sigma, D-(+) GLİKOZ susuz SIGMA ULTRA G7528) 1 M MEM
- 5 ml Penisilin-Streptomisin (Invitrogen, 15.140-122)
- 5 ml sodyum piruvat çözüm (Sigma, S8636)
- 12.5 ml Hepes çözüm 1 M (Sigma, H0887)
- 5 ml N-2 Eki (100X), sıvı (Invitrogen, 17.502-048)
- 50 ml At Serum, Isı-İnaktive (Invitrogen, 26.050-088)
Papain çözüm:
- Worthington papain-022 flakon (LK003178; nihai konsantrasyonu, 20 U / ml), diseksiyon medya 5 ml ve 37 ° C 60 dakika inkübe edin.
- P1 (genellikle 2 yavrular) ulusal düzenlemeler ve yerel Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanmış ve onaylanan yönergeleri izleyerek yaşlı sıçan yavrular başını kesmek.
- Petri kabındaki soğuk diseksiyon medya ile doldurulmuş deri ve kafatası yer ve beyin çıkarın.
- Meninksler kaldırıldı, her iki yarımkürede incelemek ve hippocampi teşrih.
- Hippocampi ~ 37 ° papain çözüm 1X1 mm parçaları ve hazmı ° C 11-13 dakika süreyle içine doğrayın.
- Doku parçaları yerleştikten sonra, kaldırmak dikkatle papain ve enzim bütün izlerini kaldırmak için 5 ml hipokampal orta eklemek. Hipokampal orta (2 ml) ve bu adımı tekrar süspansiyon tekrarlayın.
- Kümeleri, üç aşamalı olarak küçük delikleri (1000 mm, ~ 500 mm ~ 300 mikron) alev cilalı pipetler sol kalmayana dek hücreleri ~ 5 kez Karışım.
- Triturated sonra, bir hücre süzgeç (gözenek boyutu, 70 mikron, BD Bioscience) aracılığıyla hücrelere geçerler. 10 ul süspansiyon hücreleri saymak. 400.000 hücre / ml sahip amacıyla hipokampal ortamın ses seviyesini ayarlayın.
- Lamelleri kapalı laminin aspire ve lamel başına hücre süspansiyonu kapakları kuru önce, plaka 200 ul.
- Onları inkübatörde 60 dakika ekleyiniz ve sonra iyi ortalama 2 ml hipokampal orta eklemek bırakın.
- Ertesi gün, ölü hücreleri ve enkaz kaldırma ve 2 ml, önceden ısıtılmış taze hipokampal orta eklemek için eski hipokampal orta aspirat.
Bakım
Neurobasal medya:
- 500 ml neurobasal (Invitrogen, 12.348-017)
- 10 ml B27 serum serbest eki (Invitrogen, 17.504-044)
- 5 ml Penisilin-Streptomisin (Invitrogen, 15.140-122)
- 1.25 ml L-glutamin (Invitrogen, 25.030-149)
Kaplama dört gün sonra başlayan, neurobasal orta astrosit-nöron kültürler haftada iki kez besleyin. Sıcaklık ve CO 2 denge sağlaması için yaklaşık 30 dakika havalandırılan bir balonuna inkübatör medya Preincubate.
Bölüm 2: KALSİYUM GÖRÜNTÜLEME
Hipokampal kayıt tampon: 110 mM NaCl, 5.4 mMKCl, 1.8 mM CaCl 2, 0.8 mM MgCl 2, 10 mM D-glukoz, 10 mM HEPES (Sigma tüm kimyasallar), pH 7.4 (NaOH ile düzeltilmiş) .
Astrositler kalsiyum göstergesi boya yükleme
- 2 ml hipokampal kayıt tampon DMSO 2.5 mcM Fluo-4, AM (Invitrogen, F-14.217) ve% 0.05 Pluronic ® F-127% 20 çözüm içeren dolu bir 6-plaka (Invitrogen, iyi bir kültür koyun P-3000MP) ve 10-30 dakika süreyle oda sıcaklığında inkübe edin.
- Fluo-4 çözüm çıkarın ve 30 dakika oda sıcaklığında hipokampal kayıt tampon ve inkübe ile lamelleri 3 kere yıkayın.
- Lamel odasına yerleştirin ve lens temizleme sıvı ile lamel diğer tarafında temiz.
- Amaç küçük bir damla immersiyon yağı (Cargille Immersion Yağı TİPİ DF) koyun ve mikroskop (Olympus IX71) sahne odası (25 mm yuvarlak lamel için Warner Instruments Açık odası) koymak.
- Iletim ışık kullanarak hücreleri hücrelerin nasıl göründüğüne bakmak ve onları almak için odak noktası haline bakın. Sonra (Vizyon KADAR Polychrome V) monokromatör gelen 488 nm hücreleri aydınlatmak ve Fluo-4 floresan sinyal üniforma ve astrositler saptanabilir olup olmadığını belirlemek.
- EPI ve TIRF aydınlatma astrositler kalsiyum ölçmek için kullanın.
TIRF mikroskopi
Kısaca, biz bir Andor IXON DV887DCS EMCCD kamera ile donatılmış bir Olympus IX71 mikroskop kullanıyoruz. Eksitasyon ve görüntü alımı kontrolü TILLVision yazılımı kullanılarak elde edilir. 454/488/515 nm Argon (100 mW) ve 442 nm (45 mW) katı hal lazerleri kirişler kombine ve kontrollü bir KADAR Polyline lazer birleştirici, TIRF çift bağlantı kondansatör ve acoustoptical arasında ayarlanabilir filtre ve denetleyicisi (AOTF tüm TIRF kondenser içine giriş için Kineflex geniş bant fiber içine Fotonik) ve beslenen KADAR. Biz TIRF elde etmek için Olympus 60X 1.45 NA lens kullanın. Kamera kazancı en iyi sinyal-gürültü görüntüleri sağlamak için her astrosit ayarlanır. Arka plan ve TIRF mikroskopi ilkeleri, son zamanlarda, 5 4 gözden geçirilmiştir . Kullandığımız optik bileşenlerin çoğu şimdi Agilent Technologies (http://www.till-photonics.com/) bir parçası Fotonik, KADAR satın alındı. TIR penetrasyon derinliği aşağıdaki denklemler hesaplanabilir.
d = penetrasyon derinliği
n1 = cam kırılma indisi
n2 = kırılma indisi hücre
insidansı = açısı
NAI = sayısal açıklık insidansı
Lazer TIRF için optimal aynı hizada olmasını sağlamak için 100 nm floresan boncuk (Invitrogen, F8803) gözlemlemek için yararlı bulabilirsiniz. Biz hala EPI ve TIRF mikroskopi ile boncuk çerçeveleri ve videoları mevcut. Zaman TIRF, bir sinyal-gürültü dramatik bir artış gözlemlemiştir ve boncuk Brown difüzyon gösterilecek. Kritik açı eşit olmasaydı oluşacak tehlikeye eğik aydınlatma yerine daha optimum TIRF oluşur emin olmak için düzenli olarak (haftada ~ kez) TIRF mikroskobu ile 100 nm boncuk davranışlarını gözlemlemek için yararlı buluyorum α (bkz. Şekil 1).
G-protein kenetli reseptör agonistleri Uygulama
Astrositler Gq-reseptörler 6, 7 metabotropik glutamat reseptörleri ve P2Y reseptörleri (agonist, ATP, ADP) de dahil olmak üzere çeşitli ifade eder. Bu reseptörlerin aktivasyonu astrositler içinde hücre içi kalsiyum düzeylerinde önemli artışlara yol açar. Örneğin, bir hücre içi kalsiyum yükselmeler astrositler 8-10 ATP (30 mcM) uygulama sırasında kolayca izleyebilirsiniz . Warner Instruments switcher VC-77SP Hızlı Adım Perfüzyon Sistemi (http://www.warneronline.com/index.cfm) olarak adlandırılan hızlı bir çözüm kullanın. ~ 10 ms 'den daha az bir süre içinde bu yöntemi çözümleri uygulanabilir.
ŞEKİL 1 Karikatür ve fotoğrafları görüntüleme kurdu. A., (B) lazer montaj, kontrolörler ve kiriş kutuları bir fotoğraf gösterir iken, üzerine monte edilmiş bir airtable mikroskop bir fotoğraf gösterir. C. mikroskop aşamasında bir fotoğraf görüntüleme için monte edilen oda gösterir. Hızlı perfüzyon cihazı (step motor ve teta tüp ile birlikte) görülebilir bıraktı. Sağ tarafta bir Axopatch 200A amplifikatör headstage görülür. Karikatür set ışık yolu schematizes ve nasıl TIRF elde edilir. Lazer, kritik açı α immersiyon ortaya çıkar, böylece merkezi ayarlanır 60X 1.45 NA objektif lens ve konumunu arka odak düzlemi üzerinde duruldu. Bu noktada demiri düşük kırılma indisi orta mesafe λ (ana metin denklemi) ile toplam iç yansıma ve bozunur muzdarip. Bu durumda bu kayıt tampon astrositler ve astrositler kendilerini çevreleyen. Sonuç olarak plazma zarı ~ 100 nm içinde moleküllerin optik uyarım (ve dolayısıyla görüntüleme). Hücre içinde veya hücrenin üst yüzeyinde bu heyecanlı ise hücre karikatür, yeşil "heyecan" membran reseptörleri olarak gösterilir. TIRF mikroskopi tam bir hesap Steyer ve Almers 4 tarafından sağlanmıştır.
ŞEKİL 2 EPI ve TIRF mikroskobu ile elde edilen 100 nm floresan boncuk Görüntüler. A. birkaç düzine 100 nm floresan boncuk manzaralı bir alan EPI görüntüleri gösterir. Mavi ok ucu suya difüzyon. Boncuk noktası ise, cam lamel üzerine yerleşmiş boncuk kırmızı oklar noktası. B. Bu görüşe göre, sadece kırmızı oklarla gösterilen yapışık boncuk görünür A'da gösterildiği gibi aynı alan TIRF bir görüntü gösterir. Bu cam coverlsip üzerine yerleşti ve böylece ~ 100 nm kaybolan saha içinde vardı çünkü. Boncuk mavi oklarla gösterilen bu bölge içinde değildir ve TIRF görüntüleri böylece görünmez. Düşük araziler görüntülerin 3D render göstermektedir. Bu sinyal-gürültü TIRF mikroskopi tarafından gözlemlenen büyük bir artış kaybolan alanı içinde boncuklar oluşur açıktır. Aslında bu görüntüler için TIRF için 20 iken ± 0.7 EPI için sinyal-gürültü, 7.1 ± 0.6 idi.
ŞEKİL 3 EPI ve TIRF mikroskobu ile elde Fluo-4 kalsiyum gösterge boyası ile yüklü astrositler Görüntüler. Beş astrositler manzaralı bir alan A. EPI görüntüler. B. A, A ve B görüntüleri anlamlı derecede farklı olduğunu B. Not gösterilen bakış aynı alanda TIRF görüntü. Bu TIRF aydınlatma ile cam lamel yakın apozisyon sadece plazma zarı bölgelerde görüntülü çünkü. Alt panelleri göstermek ATP-uyarılmış hücre içi kalsiyum transientler EPI ve TIRF mikroskobu ile görüntülenmiş.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Astrositler hücre içi kalsiyum yükselmeler görüntüler çok iyi kurulmuştur. Bu, kendiliğinden meydana gelen nöronal aktivite veya 11 astrosit yüzey reseptörleri aktive agonistleri uygulama tarafından tetiklenebilir. Bir önemli ve tartışmalı bir konu olmadığını astrosit hücre içi kalsiyum yükselmeleri, nöronlar 11, 12 reseptörleri aktive sinyal molekülleri serbest bırakılması tetikleyebilir. Yorum Haydon 7, 13 ve McCarthy 11 laboratuvarları tarafından vurgulanan bu görüşe karşı kanıt olmuştur, çünkü bu tartışmalı bir konudur. , Yeni bir hipotez odaklı deneyler nasıl astrositler etkisi nöronlar 14 belirlemek için tasarlanmış olabilir önce astrosit kalsiyum dinamikleri daha iyi ve hassas bir anlayışa ihtiyaç olduğunu savundu son beyin kesit görüntüleme ve elektrofizyoloji verileri geçerli . Bu video makalede plazma membran ve kültürlü astrositler neredeyse aynı anda küresel hücre içi kalsiyum değişiklikleri yakın görüntü basit bir yöntem mevcut. TIRF mikroskopi kaçınılmaz bir teknik gereklilik, kaybolan alan derinliği 3 içerisinde bir cam lamel uygun, çünkü kültür hücreleri kullanılır olması gerektiği . Bu kültür astrositler in vivo 15 ile kıyaslandığında gen ekspresyon profilleri değiştirmek ve Bu yöntemi uygularken, bu nedenle bu ihtar düşünülmelidir fazlalaştı . Ancak akılda bu dikkate alınarak rapor basit bir yöntem görüntüye izin vermez ve hemen hemen eş zamanlı olarak, plazma membranı ve küresel hücre içi kalsiyum değişimleri yakın ölçmek. Astrositler yaklaşımın daha fazla uygulama astrositler plazma membran yakın hücre içi kalsiyum değişiklikler hakkında doğru veri sağlama sözünü tutar. Bu tür nicel veri kullanılabilirliği astrosit biyoloji tam anlaşılması için yararlı olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Bu çalışma, Japonya Uehara Memorial Foundation (ES) yanı sıra Whitehall Vakfı, Ulusal Nörolojik Bozukluklar ve İnme ve Stein-Oppenheimer Endowment Ödülü (BSK) Enstitüsü tarafından desteklendi.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| VWR® Micro Cover Slips, Round, No. 1 | Tool | VWR international | 48380-068 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Reagent | Sigma-Aldrich | P0899 | |
| Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane | Reagent | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| Earle’s Balanced Salt Solution (EBSS) (1X), liquid | Reagent | Invitrogen | 14155-063 | |
| Minimum Essential Medium (MEM) (1X), liquid Contains Earle’s salts, but no L-glutamine or phenol red | Reagent | Invitrogen | 51200-038 | |
| Penicillin-Streptomycin liquid | Reagent | Invitrogen | 15140-122 | |
| Sodium pyruvate solution | Reagent | Sigma-Aldrich | S8636 | |
| HEPES solution 1 M | Reagent | Sigma-Aldrich | H0887 | |
| N-2 Supplement (100X), liquid | Reagent | Invitrogen | 17502-048 | |
| Horse Serum, Heat-Inactivated | Reagent | Invitrogen | 26050-088 | |
| PAPAIN-022 | Reagent | Worthington Biochemical | LK003178 | |
| Neurobasal™ Medium (1X) Liquid without Phenol Red | Reagent | Invitrogen | 12348-017 | |
| B-27 Serum-Free Supplement (50X), liquid | Reagent | Invitrogen | 17504-044 | |
| L-Glutamine-200 mM (100X), liquid | Reagent | Invitrogen | 25030-149 | |
| Cell Strainers | Tool | BD Biosciences | 352350 | |
| BD Falcon Multiwell Flat-Bottom Plates with Lids, Sterile | Tool | BD Biosciences | 353046 | |
| NaCl | Reagent | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| KCl | Reagent | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| CaCl2 hexahydrate | Reagent | Sigma-Aldrich | 21108 | |
| MgCl2 hexahydrate | Reagent | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| HEPES free acid | Reagent | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| D-(+)-glucose | Reagent | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| Fluo-4, AM 1 mM solution in DMSO | Reagent | Invitrogen | F-14217 | |
| Pluronic® F-127 20% solution in DMSO | Reagent | Invitrogen | P-3000MP | |
| Immersion Oil TYPE DF | Microscope | Cargill Labs | 16242 | |
| Open chamber for 25 mm round coverslips, 100 μl volume | Tool | Warner Instruments | 64-0362 (RC-21BDW) | |
| P-2 platform for Series 20 chambers, non-heater | Tool | Warner Instruments | 64-0278 (P-2) | |
| FluoSpheres carboxylate-modified microspheres, 0.1 μm, yellow-green fluorescent (505/515) 2% solids | Reagent | Invitrogen | F8803 |
References
- Richler, E., Chaumont, S., Shigetomi, E., Sagasti, A., Khakh, B. S. An approach to image activation of transmitter-gated P2X receptors in vitro and in vivo. Nature Methods. 5, 87-93 (2008).
- Granseth, B., Odermatt, B., Royle, S. J., Lagnado, L. Clathrin-mediated endocytosis is the dominant mechanism of vesicle retrieval at hippocampal synapses. Neuron. 51, 773-786 (2006).
- Nunez, J. Primary culture of hippocampal neurons from P0 newborn rats. J Vis Exp. 19, (2008).
- Steyer, J. A., Almers, W. A real-time view of life within 100 nm of the plasma membrane. Nat Rev Mol Cell Biol. 2, 268-275 (2001).
- Jaiswal, J. K., Fix, M., Takano, T., Nedergaard, M., Simon, S. M. Resolving vesicle fusion from lysis to monitor calcium-triggered lysosomal exocytosis in astrocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 14151-14156 (2007).
- Araque, A., Carmignoto, G., Haydon, P. G. Dynamic signalling between astrocytes and neurons. Annu Rev Physiol. 63, 795-813 (2001).
- Haydon, P. G. GLIA: listening and talking to the synapse. Nat Rev Neurosci. 2, 185-193 (2001).
- Bowser, D. N., Khakh, B. S. ATP excites interneurons and astrocytes to increase synaptic inhibition in neuronal networks. J Neurosci. 24, 8606-8620 (2004).
- Bowser, D. N., Khakh, B. S. Two forms of astrocyte single vesicle exocytosis imaged with total internal reflection fluorescence microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 4212-4217 (2007).
- Bowser, D. N., Khakh, B. S. Vesicular ATP is the predominant cause of intercellular calcium waves in astrocytes. J Gen Physiol. 129, 485-491 (2007).
- Agulhon, C. What is the role of astrocyte calcium in neurophysiology. Neuron. 59, 932-946 (2008).
- Barres, B. A. The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease. Neuron. 60, 430-440 (2008).
- Lee, S. Y., Haydon, P. G. Astrocytic glutamate targets NMDA receptors. J Physiol. 581, 887-888 (2007).
- Shigetomi, E., Bowser, D. N., Sofroniew, M. V., Khakh, B. S. Two forms of astrocyte calcium excitability have distinct effects on NMDA receptor-mediated slow inward currents in pyramidal neurons. J Neurosci. 28, 6659-6663 (2008).
- Cahoy, J. D. A transcriptome database for astrocytes, neurons, and oligodendrocytes: a new resource for understanding brain development and function. J Neurosci. 28, 264-278 (2008).
