Summary
We beschrijven hoe te meten in de buurt van membraan en de wereldwijde intracellulair calcium dynamiek in gekweekte astrocyten met behulp van totale interne reflectie en epifluorescentie microscopie.
Abstract
De hersenen bevatten gliacellen. Astrocyten, een soort van gliale cel, zijn al lange tijd bekend dat een passieve ondersteunende rol te verstrekken aan neuronen. Echter, steeds meer bewijs suggereert dat astrocyten kunnen ook actief in de hersenfunctie deel te nemen door middel van functionele interactie met neuronen. Echter, veel fundamentele aspecten van de biologie astrocyte blijven controversieel, onduidelijk en / of experimenteel onontgonnen. Een belangrijk punt is de dynamiek van de intracellulaire calcium transiënten in astrocyten. Dit is relevant omdat calcium is goed ingeburgerd als een belangrijke tweede boodschapper en omdat is voorgesteld dat astrocyten calcium verhogingen kan de afgifte van zenders van astrocyten te activeren. Toch is er nog geen gedetailleerd of bevredigende beschrijving van de buurt plasmamembraan calcium signalisatie in astrocyten. Totale interne reflectie fluorescentie (TIRF) microscopie is een krachtig hulpmiddel om fysiologisch relevante signalering gebeurtenissen te analyseren binnen ongeveer 100 nm van het plasmamembraan van levende cellen. Hier gebruiken we TIRF microscopie en hoe dat monitor in de buurt plasmamembraan en de wereldwijde intracellulair calcium dynamiek vrijwel gelijktijdig. De verdere verfijning en systematische toepassing van deze aanpak heeft de potentie om te informeren over de precieze details van astrocyten calcium signalering. Een gedetailleerde kennis van astrocyten calcium dynamiek kan een basis bieden om te begrijpen of, hoe, wanneer en waarom astrocyten en neuronen ondergaan calcium-afhankelijke functionele interacties.
Protocol
Experimentele procedures
De experimentele procedure bestaat uit twee belangrijke onderdelen die hieronder worden beschreven in een stapsgewijze manier.
Deel 1: VOORBEREIDING hippocampus astrocyten CULTUREN
In het kort werden gemengd hippocampal astrocyten-neuron culturen bereid met behulp van een gevestigde protocol 1,2,3. We geoptimaliseerd de procedure om een gezonde gekweekte astrocyten opleveren. Alle procedures hieronder vermelde moet worden uitgevoerd in een steriele omgeving, zoals een laminaire stroming kap.
Voorbereiden coverslips
- 22 mm dekglaasjes (VWR, 48380-068)
- Poly-D-Lysine (PDL, Sigma P0899), porties (1 mg / ml)
- Laminine monsters (20 ug / ml): 49 ml steriel water toe te voegen aan 1 mg / ml laminine-oplossing (Sigma L2020), maken 1,2 ml porties en bewaar bij -20 ° C
- Los PDL in steriel water (50 ug / ml)
- Autoclave de dekglaasjes, spoelen met steriel water en plaats in de PDL (20 ml voor 100 dekglaasjes). 'S nachts vertrekken bij kamertemperatuur.
- Vervang de PDL met steriel water (3 uitgebreide wasbeurten). Dan droog de dekglaasjes en bewaar bij 4 ° C.
- De dag voor beplating van de astrocyten, plaats de individuele dekglaasjes in een steriele goed op een 6-well plaat (Multiwell Flat-bodemplaten met deksels, steriel van BD Bioscience). Doe 400 ul van laminine op elke dekglaasje en incubeer overnacht, in de couveuse om de verdamping te voorkomen.
Ontleding
Dissection media:
- 500 Balanced Salt ml Earle's Solution (EBSS) (1x), vloeistof (Invitrogen, 14.155-063)
- 5 ml HEPES oplossing (Sigma, H0887)
Hippocampale media:
- 412,5 ml Minimum Essential Medium (MEM) (1x), vloeibare Bevat Earle's zouten, maar geen L-glutamine of fenol rood (Invitrogen, 51200-038)
- 10 ml glucose (Sigma, D-(+)-glucose WATERVRIJE SIGMA ULTRA G7528), een M in MEM
- 5 ml penicilline-streptomycine (Invitrogen, 15140-122)
- 5 ml natriumpyruvaat oplossing (Sigma, S8636)
- 12,5 ml HEPES oplossing 1 M (Sigma, H0887)
- 5 ml N-2 Supplement (100X), vloeistof (Invitrogen, 17.502-048)
- 50 ml Horse Serum, hitte-geïnactiveerd (Invitrogen, 26050-088)
Papaïne oplossing:
- Voeg 5 ml van de dissectie media in Worthington PAPAÏNE-022 flacon (LK003178; uiteindelijke concentratie van 20 U / ml) en incubeer bij 37 ° C gedurende 60 minuten.
- Onthoofden rat pups leeftijd van P1 (normaal 2 pups) volgende richtlijnen gescreend en goedgekeurd door de nationale regelgeving en de lokale institutionele Dierverzorging en gebruik Comite.
- Verwijder het vel en de schedel en de hersenen plaats in de petrischaal gevuld met koud dissectie media.
- Verwijderde hersenvliezen, ontleden beide halfronden en ontleden hippocampus.
- Hak de hippocampus naar ~ 1X1 mm stukken en verteren in papaïne oplossing bij 37 ° C gedurende 11-13 minuten.
- Zodra de stukjes weefsel hebben gevestigd, te verwijderen papaïne voorzichtig en voeg 5 ml van de hippocampus medium om alle sporen van het enzym te verwijderen. Herhaal deze stap en resuspendeer in de hippocampus medium (2 ml).
- Vermaal de cellen ~ 5 keer totdat er geen klonten links, met drie vlam gepolijst pipetten van steeds kleinere boringen (1000 pm, ~ en ~ 500 pm 300 pm).
- Eenmaal gewreven, gaan de cellen door middel van een cel-zeef (poriegrootte, 70 micrometer, BD Bioscience). Tel de cellen in 10 ul van de opschorting. Pas het volume van de hippocampus medium om 400.000 cellen / ml hebben.
- Zuig het laminine uit de dekglaasjes, en voor de covers kunnen drogen, plaat 200 pi van de celsuspensie per dekglaasje aan.
- Laat ze te bevestigen voor 60 min in de couveuse, en daarna 2 ml van de hippocampus medium per well toe te voegen.
- De volgende dag, aspiratie oud hippocampus medium om dode cellen en vuil te verwijderen en 2 ml van de voorverwarmde verse hippocampus medium toe te voegen.
Onderhoud
Neurobasal media:
- 500 ml neurobasal (Invitrogen, 12348-017)
- 10 ml serum B27 gratis aan te vullen (Invitrogen, 17504-044)
- 5 ml penicilline-streptomycine (Invitrogen, 15140-122)
- 1,25 ml L-glutamine (Invitrogen, 25030-149)
Voer de astrocyt-neuron culturen twee keer per week met neurobasal medium, te beginnen vier dagen na plating. Preincubate de media over 30 min in de incubator in een geventileerde kolf de temperatuur en de CO 2 evenwicht.
Deel 2: CALCIUM IMAGING
Hippocampus opname buffer: 110 mM NaCl, 5,4 mMKCl, 1,8 mM CaCl2, 0,8 mM MgCl2, 10 mM D-glucose, 10 mM HEPES (Alle chemicaliën van Sigma) pH 7,4 (ingesteld met NaOH).
Het laden van calcium indicator kleurstof in astrocyten
- Plaats de cultuur in een goed op een 6-wells plaat gevuld met 2 ml hippocampus opname buffer met 2,5 uM Fluo-4, AM (Invitrogen, F-14217) en 0,05% Pluronic ® F-127 20%-oplossing in DMSO (Invitrogen, P-3000MP) en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10-30 minuten.
- Verwijder Fluo-4-oplossing en was coverslips drie keer met de hippocampus opname buffer en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
- Plaats het dekglaasje op de kamer, en reinig de andere kant van dekglaasje met lens reinigingsvloeistof.
- Doe een kleine druppel immersie-olie (Immersion Olie Type DF uit Cargille) over de doelstelling en zet kamer (Open kamer voor 25 mm ronde dekglaasje van Warner Instruments) op het podium van de microscoop (Olympus IX71).
- Kijk naar de cellen met behulp van transmissie-licht om te zien hoe de cellen kijken, en krijgen ze in focus. Dan verlichten de cellen met 488 nm uit een monochromator (V Polychrome van TILL Vision) en bepalen of de fluorescentie-signaal van Fluo-4 is uniform en aantoonbaar in astrocyten.
- Gebruik EPI en TIRF verlichting aan calcium te meten in astrocyten.
TIRF microscopie
Kortom, we gebruik van een Olympus IX71 microscoop uitgerust met een Andor IXON DV887DCS EMCCD camera. De controle van excitatie en beeld acquisitie is bereikt met behulp van TILLVision software. De balken van 454/488/515 nm Argon (100 mW) en 442 nm solid state (45 mW) lasers worden gecombineerd en gecontroleerd met een TILL Polyline laser combiner, TIRF dual port condensor en acoustoptical afstembare filter en de controller (AOTF; allemaal uit TILL Fotonica) en ingevoerd in een Kineflex brede band vezel voor toetreding tot de TIRF condensor. We maken gebruik van een Olympus 60X 1,45 NA lens te TIRF te bereiken. De camera versterking is ingesteld voor elke astrocyten om het beste signaal te verstrekken aan ruis. De achtergrond en principes van TIRF microscopie zijn onlangs beoordeeld vier, vijf. Het merendeel van de optische componenten die we gebruiken werden gekocht van TILL Photonics, dat nu deel uitmaakt van Agilent Technologies (http://www.till-photonics.com/). De TIR-penetratie diepte kan worden berekend uit de vergelijkingen hieronder.
d = indringdiepte
n1 = brekingsindex van glas
n2 = brekingsindex van de cel
a = hoek van inval
NAi = numerieke apertuur van de incidentie
Om ervoor te zorgen de laser is optimaal afgestemd voor TIRF we vinden het nuttig om 100 nm TL-bead (Invitrogen, F8803) te observeren. We hebben nu nog beelden en video's van kralen met EPI en TIRF microscopie. Wanneer u in TIRF, observeert men een dramatische toename in signaal-ruis en de kralen weer te geven Brownse diffusie. We vinden het nuttig om het gedrag van 100 nm kralen met TIRF microscopie op regelmatige basis (~ een keer per week) om er zeker van dat optimale TIRF gebeurt, in plaats van de besmette schuin verlichting die zich zou voordoen in acht als de kritische hoek waren niet gelijk aan α (zie figuur 1).
Toepassing van de G-eiwit gekoppelde receptor agonisten
Astrocyten express een verscheidenheid van GQ-gekoppelde receptoren 6, 7 waaronder metabotrope glutamaat receptoren en P2Y receptoren (agonist, ATP, ADP). Activatie van deze receptoren leidt tot een aanzienlijke stijging van de intracellulaire calcium niveaus binnen astrocyten. Zo kan men gemakkelijk waarnemen intracellulair calcium verhogingen tijdens het aanbrengen van ATP (30 pM) tot astrocyten 8-10. We maken gebruik van een snelle oplossing switcher van Warner Instruments genaamd de VC-77SP Fast-Step Perfusie System (http://www.warneronline.com/index.cfm). Met deze methode oplossingen kunnen worden toegepast in minder dan ~ 10 ms.
Figuur 1. Cartoon en foto's van de beeldvorming opgezet. A. Geeft een foto van de microscoop gemonteerd op een airtable, terwijl (B) toont een foto van de laser montage, controllers en beam dozen. C. Geeft een foto van de microscoop podium met de kamer geplaatst voor de beeldvorming. Aan de linkerkant de snelle perfusie apparaat kan worden gezien (samen met de stappenmotor en theta slangen). Aan de rechterkant van de headstage van een Axopatch 200A versterker wordt gezien. De cartoon schematiseert het licht pad in de set-up en hoe TIRF is bereikt. De laser is gericht op de achterkant brandvlak van de 60X 1,45 NA objectief en zijn positie is aangepast uit het midden, zodat het naar voren komt in de immersie olie op de kritische hoek α. Op dit punt van de straal last van totale interne reflectie en vervalt met een afstand λ (zie de vergelijking in de hoofdtekst) in het medium van de lagere brekingsindex. In dit geval is dat de opname buffer rond de astrocyten en de astrocyten zelf. Het resultaat is een optische excitatie (en dus beeldvorming) van moleculen binnen ~ 100 nm van het plasmamembraan. In de cartoon van de cel is dit weergegeven als groen "enthousiast" membraan receptoren, terwijl die in de cel of op de bovenkant van de cel zijn niet enthousiast. Een volledig verslag van TIRF microscopie is verstrekt door Steyer en Almers 4.
Figuur 2. Afbeeldingen van 100 nm fluorescerende bolletjes verworven met EPI en TIRF microscopie. A. Geeft EPI beelden van een gezichtsveld met enkele tientallen 100 nm fluorescerende kralen. De rode pijlen wijzen naar kralen die hebben gevestigd op de glazen dekglaasje, terwijl het blauwe pijlpunten wijzen kralen die zijn verspreiden in water. B. Toont een TIRF beeld van hetzelfde gezichtsveld zoals in A. In deze visie alleen de aanhanger kralen aangegeven door rode pijlen zichtbaar zijn. Dit komt omdat deze had gevestigd op de glazen coverlsip en dus binnen de ~ 100 nm evanescente veld. De kralen die in A door blauwe pijlen zijn niet in deze regio en zijn dus onzichtbaar in de TIRF beelden. De lagere kavels tonen 3D-weergave van de beelden. Het is duidelijk dat een grote toename in signaal-ruis voor kralen binnen de evanescente veld toen waargenomen door TIRF microscopie. In feite voor deze beelden de signaal-ruisverhouding voor de EPI was 7,1 ± 0,6, terwijl het voor TIRF het was 20 ± 0,7.
Figuur 3. Beelden van astrocyten geladen met Fluo-4 calcium indicator kleurstof verworven met EPI en TIRF microscopie. A. EPI beelden van een gezichtsveld met vijf astrocyten. B. Een TIRF beeld van hetzelfde gezichtsveld getoond in B. Merk op dat de beelden in A en B zijn significant verschillend. Dit is omdat met TIRF verlichting alleen de plasmamembraan regio's in nauwe appositie bij de glazen dekglaasje worden afgebeeld. De onderste panelen tonen ATP opgewekte intracellulair calcium transiënten afgebeeld met EPI en TIRF microscopie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het is goed vast te staan dat astrocyten intracellulair calcium verhogingen weer te geven. Deze zich voordoen spontaan, kan worden veroorzaakt door neuronale activiteit of door toepassing van agonisten aan receptoren activeren op de astrocyt oppervlak 11. Een belangrijke en controversiële kwestie is of de astrocyten intracellulair calcium hoogtes kan leiden tot het vrijkomen van signaalmoleculen die receptoren te activeren op neuronen 11, 12. Dit is controversieel omdat er bewijzen voor en tegen deze opvatting, zoals blijkt uit de beoordelingen door de Haydon 7, 13 en McCarthy 11 laboratoria. Op basis van onze recente hersenen slice imaging en electrofysiologie gegevens die we gesteld dat een beter en juist begrip van astrocyten calcium dynamiek is nodig voordat nieuwe hypothese gedreven experimenten kunnen worden ontworpen om te bepalen hoe astrocyten invloed neuronen 14. In deze video artikel geven we een eenvoudige methode om de afbeelding in de buurt van plasma membraan en de wereldwijde intracellulair calcium verandert bijna gelijktijdig in gekweekte astrocyten. Een onvermijdelijke technische vereiste van TIRF microscopie is dat de gekweekte cellen moeten worden gebruikt, omdat ze om een glazen dekglaasje zich binnen de evanescente veld diepte 3. Het is vermeldenswaard dat astrocyten in de cultuur van hun genexpressie profielen te wijzigen in vergelijking met die in vivo 15, en dus dit voorbehoud dient te worden overwogen bij de uitvoering van deze methode. Met deze overweging in het achterhoofd maar de eenvoudige methode die wij toelaten dat een rapport wordt om beeld en te kwantificeren in de buurt van plasma membraan en de wereldwijde intracellulair calcium verandert vrijwel gelijktijdig. De verdere toepassing van de aanpak van astrocytes houdt de belofte van het verstrekken van nauwkeurige gegevens over intracellulair calcium verandert de buurt van de plasmamembraan van astrocyten. De beschikbaarheid van dergelijke kwantitatieve gegevens nuttig zal zijn voor het volledig begrip van astrocyten biologie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de Uehara Memorial Foundation van Japan (tot ES), alsmede de Whitehall Stichting, het Nationaal Instituut voor Neurologische Aandoeningen en Stroke en een Stein-Oppenheimer Endowment Award (voor BSK).
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| VWR® Micro Cover Slips, Round, No. 1 | Tool | VWR international | 48380-068 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Reagent | Sigma-Aldrich | P0899 | |
| Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane | Reagent | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| Earle’s Balanced Salt Solution (EBSS) (1X), liquid | Reagent | Invitrogen | 14155-063 | |
| Minimum Essential Medium (MEM) (1X), liquid Contains Earle’s salts, but no L-glutamine or phenol red | Reagent | Invitrogen | 51200-038 | |
| Penicillin-Streptomycin liquid | Reagent | Invitrogen | 15140-122 | |
| Sodium pyruvate solution | Reagent | Sigma-Aldrich | S8636 | |
| HEPES solution 1 M | Reagent | Sigma-Aldrich | H0887 | |
| N-2 Supplement (100X), liquid | Reagent | Invitrogen | 17502-048 | |
| Horse Serum, Heat-Inactivated | Reagent | Invitrogen | 26050-088 | |
| PAPAIN-022 | Reagent | Worthington Biochemical | LK003178 | |
| Neurobasal™ Medium (1X) Liquid without Phenol Red | Reagent | Invitrogen | 12348-017 | |
| B-27 Serum-Free Supplement (50X), liquid | Reagent | Invitrogen | 17504-044 | |
| L-Glutamine-200 mM (100X), liquid | Reagent | Invitrogen | 25030-149 | |
| Cell Strainers | Tool | BD Biosciences | 352350 | |
| BD Falcon Multiwell Flat-Bottom Plates with Lids, Sterile | Tool | BD Biosciences | 353046 | |
| NaCl | Reagent | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| KCl | Reagent | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| CaCl2 hexahydrate | Reagent | Sigma-Aldrich | 21108 | |
| MgCl2 hexahydrate | Reagent | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| HEPES free acid | Reagent | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| D-(+)-glucose | Reagent | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| Fluo-4, AM 1 mM solution in DMSO | Reagent | Invitrogen | F-14217 | |
| Pluronic® F-127 20% solution in DMSO | Reagent | Invitrogen | P-3000MP | |
| Immersion Oil TYPE DF | Microscope | Cargill Labs | 16242 | |
| Open chamber for 25 mm round coverslips, 100 μl volume | Tool | Warner Instruments | 64-0362 (RC-21BDW) | |
| P-2 platform for Series 20 chambers, non-heater | Tool | Warner Instruments | 64-0278 (P-2) | |
| FluoSpheres carboxylate-modified microspheres, 0.1 μm, yellow-green fluorescent (505/515) 2% solids | Reagent | Invitrogen | F8803 |
References
- Richler, E., Chaumont, S., Shigetomi, E., Sagasti, A., Khakh, B. S. An approach to image activation of transmitter-gated P2X receptors in vitro and in vivo. Nature Methods. 5, 87-93 (2008).
- Granseth, B., Odermatt, B., Royle, S. J., Lagnado, L. Clathrin-mediated endocytosis is the dominant mechanism of vesicle retrieval at hippocampal synapses. Neuron. 51, 773-786 (2006).
- Nunez, J. Primary culture of hippocampal neurons from P0 newborn rats. J Vis Exp. 19, (2008).
- Steyer, J. A., Almers, W. A real-time view of life within 100 nm of the plasma membrane. Nat Rev Mol Cell Biol. 2, 268-275 (2001).
- Jaiswal, J. K., Fix, M., Takano, T., Nedergaard, M., Simon, S. M. Resolving vesicle fusion from lysis to monitor calcium-triggered lysosomal exocytosis in astrocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 14151-14156 (2007).
- Araque, A., Carmignoto, G., Haydon, P. G. Dynamic signalling between astrocytes and neurons. Annu Rev Physiol. 63, 795-813 (2001).
- Haydon, P. G. GLIA: listening and talking to the synapse. Nat Rev Neurosci. 2, 185-193 (2001).
- Bowser, D. N., Khakh, B. S. ATP excites interneurons and astrocytes to increase synaptic inhibition in neuronal networks. J Neurosci. 24, 8606-8620 (2004).
- Bowser, D. N., Khakh, B. S. Two forms of astrocyte single vesicle exocytosis imaged with total internal reflection fluorescence microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 4212-4217 (2007).
- Bowser, D. N., Khakh, B. S. Vesicular ATP is the predominant cause of intercellular calcium waves in astrocytes. J Gen Physiol. 129, 485-491 (2007).
- Agulhon, C. What is the role of astrocyte calcium in neurophysiology. Neuron. 59, 932-946 (2008).
- Barres, B. A. The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease. Neuron. 60, 430-440 (2008).
- Lee, S. Y., Haydon, P. G. Astrocytic glutamate targets NMDA receptors. J Physiol. 581, 887-888 (2007).
- Shigetomi, E., Bowser, D. N., Sofroniew, M. V., Khakh, B. S. Two forms of astrocyte calcium excitability have distinct effects on NMDA receptor-mediated slow inward currents in pyramidal neurons. J Neurosci. 28, 6659-6663 (2008).
- Cahoy, J. D. A transcriptome database for astrocytes, neurons, and oligodendrocytes: a new resource for understanding brain development and function. J Neurosci. 28, 264-278 (2008).
