在原代培养海马神经元的密集核心囊泡的实时成像

Summary

活细胞成像研究细胞器官贩卖的动态时，特别实用。在这里，我们描述了一个致密核心囊泡在培养的神经元，采用宽视场荧光显微镜的实时成像的协议。此协议是灵活的和可适应图像的其它细胞器如线粒体，内体，和过氧化物酶。

Abstract

动态细胞过程的观测和特征，可以产生对细胞活性，不能从静态图像获得的重要信息。重要的荧光探针，尤其是绿色荧光蛋白（GFP）已经彻底改变了细胞生物学能力标签特定的细胞内的车厢和细胞结构产生。例如，允许实时成像的GFP（和其光谱变种）嵌合体的细胞骨架，细胞器运输，并在众多生物和细胞类型[1-3]膜动态动态分析。虽然实时成像已成为普遍的，这种做法仍然引起了许多技术挑战，特别是在原代培养的神经元，。挑战之一是GFP标记的蛋白质在有丝分裂后神经元的表达，另一种是能够捕捉到的荧光图像，同时最大限度地减少光毒性，漂白，并保持细胞的健康一般。在这里，我们提供了一个协议，它描述了一个脂质体转染法，收益率相对较低的转染率（0.5％），但是是完全极化神经元成像的理想选择。低转染率是至关重要的，使单个轴突和树突细胞体内的方向的特点，以确认的方向性，即运输，顺行诉逆行。我们的方法来成像GFP的表达神经元依赖于一个标准的宽视场荧光显微镜与CCD摄像头，图像采集软件，和热成像室配备。我们有成像的细胞器或结构的种类繁多，例如，没有任何特殊的光学或激发需求，比荧光灯光源的致密核心囊泡，线粒体，生长锥，与肌动蛋白。此外，不同的光谱，荧光标记的蛋白质，例如，绿色荧光蛋白和蛋白DsRed的标签，可附近同时可视化表征的合作运输或其他协调的细胞活动。成像方法，这里描述的是各种成像应用灵活，可以由实验室通过相对较少的成本提供了一个显微镜。

Protocol

第1部分：用脂质体2000（Invitrogen）的神经元的转

设备设置：

培养的大鼠或小鼠海马神经元是根据Kaech和银行家，2006 [4]。典型的转染的细胞密度为25万cells/6-cm菜。所需的试剂和设备，包括50 mM的kynurenic酸，定期台式管支架，台式冷却器（最好保持脂质体转染试剂冷），
脂质体转染试剂，MEM，离心管，micropipetters和无菌镊子。

程序：

1. 对于每一个转标签两个1.5 mL管;含有质粒DNA，含有转染试剂。以下的孵化可以在室温下进行。
   1. 结合100μL，纪念在一管1.0微克质粒DNA（不包括任何类型的补充; mem没有需要的pH值平衡的温度）。
   2. 结合在1.5毫升管100μL的MEM 6.0μL脂质体。
      1. 双转染没有调整的需要，即使脂质体：DNA比例将在这种情况下，减少了一半。 ：DNA的脂质体的比例仍然是在制造商的建议。最好是每个质粒测试的最佳表达0.5-1.0微克。
      2. 为了保持脂质体转染试剂的保质期，它应该被删除从冰箱尽可能短的时间内，台式散热器放置在不使用时。
         出冰箱的总时间应保持在最低限度。
2. 为5分钟，在室温下孵育管。
3. 在纪念解决方案的DNA转移到脂质管，并用吸管轻轻混匀，然后30分钟，在室温下孵育。
4. 25分钟后，翻转盖玻片前，加入60μL50毫米kynurenic酸，以尽量减少excitoxic损害的培养神经元的菜。
   1. 小心翻转盖玻片脚端，用无菌镊子，并安排，使它们不重叠。要小心不要划伤盖玻片的神经元表面涂层或神经胶质涂层表面的菜。
5. 从6厘米的菜约0.5毫升培养基，并轻轻地用DNA混合管，转移DNA溶液均匀介质表面上的菜淋漓。
6. 不要漩涡，但轻轻滑动盘在一个方向来回，然后停止并在垂直方向重复，均匀分布的DNA -脂质体复合物。孵育90分钟，在组织文化的孵化器（37 ° C，5％CO _2）。
7. 翻转盖玻片脚面朝下，并安排，使它们不重叠。允许表达，以进行所需的时间，通常是隔夜至48小时。

第2部分：实时成像GFP标记的培养海马神经元的密集核心囊泡

设备设置：

1. 活细胞成像需要一个装有CCD相机的荧光显微镜，我们使用了Leica DMI 6000B倒置显微镜配备徕卡变量，荧光灯。还需要的是一个温度控制器和客观加热器成像室。我们使用华纳仪器RC - 21BR修改为18毫米的盖玻片，在另外一个平台热水器（货号＃PH2）和温度控制器（货号＃TC324B）。室包含没有开放的端口，在订货时，可包括室修改。客观加热器强烈建议，以帮助保持温度盖玻片，并尽量减少由于温度的波动变化重点。图像采集与使用Metamorph（Molecular Devices公司）的软件，包括“流式”收购模式下拉一个滨松ORCA - ER。注意，我们不使用一个气候室，包围整个显微镜。这除了是昂贵的，而不是必要的，这里所描述的短期成像。
2. 其他设备和试剂，包括新鲜配制的实时成像介质（1X汉克斯与Ca ^{2 +}和Mg ^{2 +，}葡萄糖，0.6％和10mm的HEPES），额外的18毫米的玻璃盖玻片，无菌镊子，非无菌镊子，Kimwipes，真空润滑脂，和一个注射器（没有针，或改良大口径针）与申请油脂。

程序：

1. 准备鲜活成像介质（1X汉克斯与Ca ^{2 +}和Mg ^{2 +，}葡萄糖，0.6％和10mm的HEPES）。我们通常准备50mls在摄氏⁴度，在不使用时的时间和存储。最好是准备足够时间不超过一个星期。约5-10毫升，每盘的神经元。
2. 启动了显微镜，摄像机，荧光灯，和图像采集软件。还可以打开电源室平台和客观热水器。
3. 准备的想象克室。
   1. 华纳室包括一个安装的盖玻片聚四氟乙烯插入。为了便于操纵，一个标签的一侧插入“顶”永久性标记。
   2. 应用的油脂环周围的凹槽孔一侧标有“顶”总商会。避免使用多余的，因为它会进入会议厅，减少观察的区域。
   3. 使用镊子，附加一个干净的，未使用的18厘米的盖玻片厅一侧的“顶”，适用于温和的压力，在其边缘盖玻片内室的凹沟，以创建一个密封。
   4. 关闭室和一个类似戒指的油脂，适用于相反的（底部）会议厅一侧的凹槽。
   5. 广场上5​​0毫升管的盖子，这是一个理想的商会持有的准备室底部。
   6. 加入750μL的成像介质会议厅。这是一个量，但过多的油脂应防止蔓延的中期和多余的，将有助于防止泡沫细胞覆盖盖玻片应用时被困。
   7. 维持在组织培养孵化器的准备室，直到需要。长期孵化，〜1小时，应避免成像介质蒸发，改变组成。
4. 执行最后的商会大会和活细胞成像。
   1. 从孵化器的准备室和一碟转盖玻片移动组织培养罩。
   2. 最终商会大会应快速进行，以确保细胞保持在中期和浸泡在37℃不断。
   3. 用无菌镊子，小心取出转碟盖玻片，触摸盖玻片边缘Kimwipe绘制了生长介质。
   4. 将盖玻片神经端上的准备室。触摸盖玻片一侧的油脂和应用的边缘周围的压力，带来不诱捕气泡盖玻片平。如预期超额成像介质将洒出。
   5. 擦去多余的成像介质，但要小心，不要滑出位置的盖玻片。
   6. 移动平台加热器预热室，并拧紧到位室。
   7. 室转移到舞台上。
   8. 为了减少光漂白和photoxicity，调节灯泡所需的最低数额，发现转染细胞的强度。
   9. 查找感兴趣的细胞与一个低倍率的油浸物镜（40X）。坚持有计划的搜索模式，以确保最大的盖玻片的覆盖面，以避免收购多余的图像，例如，左上角盖玻片，扫描和工作的权利，这是有益的。
   10. 一次所需的领域一直位于切换到高放大倍率的石油目标（60 - 100X）。
   11. 使用“流收购”或相媲美的图像处理软件的功能，记录荧光标记的蛋白质动力学的视频。
   12. 以一个阶段的形象，为以后的分析和介绍，和任何其他（如可溶性GFP）的陪同图像。
   13. 进一步探索盖玻片，并记录下视频之前保存的所有图像。
   14. 通常情况下3-5影片从一个盖玻片被认为是成功的。光毒性和一般细胞的健康，应该牢记，作为运输中受损的细胞减少。可以监测使用相差显微镜观察细胞的健康。通常每盖玻片约30分钟的录音。

第3部分：代表性的成果：

活细胞成像观测通常由视频（又称“栈”的图像）显示来看（图1A）领域内的荧光标记的细胞器的运动。伴随着每部影片往往是支持的图像，说明细胞体，蛋白表达和/或细胞的健康水平方面的视野方向。运输的影片，可以定量分析的转变受到kymographs（图1B）。 Kymographs是并列kymograph列在每个时间点代表的扫描线的图像，说明粒子的运动。图2演示了如何在相反的方向移动的两个粒子在kymograph代表。 kymographs进一步分析可以提供关于粒子通量，速度，运行长度，反复，和固定颗粒的信息。

图1代表活细胞成像观测（A）选自mCherry的标签组织型纤溶酶原激活物（tPA）交通视频帧。单个粒子移动的顺（绿色箭头）和（二）逆行（红色箭头）的方向指示。Kymographs说明TPA - mCherry在运动轴突。水平线代表在kymographs静止的物体，而对角线代表（正斜率）或向（负斜率）的细胞体，细胞器。长的绿色和红色箭头显示运行相应的粒子在（A）。由于微管解聚剂，噻氨酯哒唑，在运输中的变化也是一个kymograph说明。注意在运动细胞器的对角线的情况下减少。

Discussion

活细胞成像是一个具有挑战性，但强大的技术，直接观察培养的神经元细胞器运输。困难可能会出现上游与神经元的健康欠佳，由于文化并发症程序。因此，细胞的健康（例子见文献4）应评估转染前后，而在生长介质中使用组织培养，光镜下观察盖玻片。转移过程中的神经元含有盖玻片成像室，可紧张的细胞，因此重要的是要小心操纵的盖玻片。它可以是共同的，健康的细胞没有运输过程中的延误，或不完整的成像介质的设备或平衡预热。对于交通分析的轴突和树突的方向必须是已知的，即区分顺行和逆行运输。因此，重要的是要确保细胞体的位置是确定的，而连接部分可以看出一个连续的神经元细胞体感兴趣的地区。通常节省重叠图像可溶性GFP，或informatively命名保存的视频文件，足以确定方向的过程，分析，例如，“Cell1CellBodyUpperLeft”。

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
MEM-Eagle with Earle salts and L-glutamine	Reagent	Mediatech, Inc.	10-010-CV
Lipofectamine 2000	Reagent	Invitrogen	11668-027	Transfection reagent
10X Hanks with Ca2+ and Mg2+	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	14185-052	Live-imaging medium
1M HEPES	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	15630-130	Live-imaging medium