初代培養海馬ニューロンにおける高密度コア小胞のライブイメージング

Summary

オルガネラの人身売買のダイナミクスを研究するときに、ライブセルイメージングには特に有用です。ここでは、広視野蛍光顕微鏡を用いた培養神経細胞における高密度コア小胞のライブイメージングのためのプロトコルについて説明します。このプロトコルは柔軟性があり、画像その他のようなミトコンドリアなどのオルガネラ、エンドソーム、およびペルオキシソームに適合させることができます。

Abstract

観測とダイナミックな細胞プロセスを特徴付けることは、静止画像から得られることができない細胞の活動に関する重要な情報を得ることができる。バイタル蛍光プローブ、特に緑色蛍光タンパク質（GFP）は、特定の細胞内区画と細胞構造を標識するために能力に起因する細胞生物学に革命をもたらしています。例えば、GFP（とそのスペクトル変異体）キメラのライブイメージングは​​、生物や細胞の種類[1-3]の多数の細胞骨格、オルガネラ輸送、および細胞膜のダイナミクスの動的解析のために許可されている。ライブイメージングが普及しているが、このアプローチは、まだ特に初代培養神経細胞で、多くの技術的課題があります。 1つの課題は、有糸分裂後のニューロンでGFP -タグ融合タンパク質の発現であり、他には、光毒性を最小限に退色し、一般的な細胞の健康を維持しながら蛍光画像をキャプチャする機能です。ここでは、比較的低いトランスフェクション率（〜0.5％）が得られる脂質ベースのトランスフェクション法を説明するプロトコルを提供する、しかし完全に偏光ニューロンの撮影に最適です。低トランスフェクション率は、単一の軸索と樹状突起が順行性V.逆行輸送、すなわち、の方向性を確認するために細胞体にその方向へと特徴付けることができるようにすることが不可欠です。イメージングGFPを発現する神経細胞への我々のアプローチは、標準的な広視野蛍光をCCDカメラを装備した顕微鏡、画像キャプチャソフトウェア、および加熱されたイメージングチャンバーに依存しています。我々は特別な光学系や蛍光灯の光源以外の励起要件なしで、例えば、高密度コア小胞、ミトコンドリア、成長円錐、およびアクチンを細胞小器官や構造体のさまざまな画像化している。さらに、スペクトル的に異なる、蛍光標識タンパク質、例えば、GFPとDsRed -タグ付きタンパク質は、共同輸送や他のコーディネート携帯電話のイベントを特徴付けるために、同時に近くに視覚化することができます。ここで説明したイメージング手法は、各種イメージングアプリケーション用の柔軟性があり、顕微鏡が使用可能な場合、比較的少ない費用のための実験室で採用することができます。

Protocol

パート1：リポフェクタミン2000（Invitrogen）を用いて神経細胞のトランスフェクション

機器のセットアップ：

ラットまたはマウスの海馬ニューロンをKaechとバンカー、2006 [4]に従って培養されています。トランスフェクションのために使用される典型的な細胞密度は、250,000 cells/6-cm皿です。必要な試薬と装置は、50mMのキヌレン酸、定期的なベンチトップ型のチューブホルダー、ベンチトップクーラーを（最高のリポフェクトアミン試薬の寒さを保つために）、含まれています
リポフェクタミン試薬、MEM、マイクロチューブ、micropipetters、および滅菌ピンセット。

手順：

1. 各トランスフェクションのラベルのための2つの1.5 mLチューブ、プラスミドDNA、トランスフェクション試薬を含む1つを含む1つ。以下のインキュベーションは、室温で進むことができます。
   1. つのチューブに100μLMEMでプラスミドDNA 1.0μgを組み合わせる（あらゆるタイプのサプリメントなしで、MEMは、平衡pHの温度である必要はありません）。
   2. 他の1.5 mlチューブに100μLMEMを6.0μLリポフェクタミンを組み合わせる。
      1. DNAの比がこのような場合には半減されます：ダブルトランスフェクションのための調整はリポフェクタミンがいても必要ありません。リポフェクタミンの比率：DNAは、製造業者の提案の中ではまだです。最適な発現のためにそれぞれのプラスミドに対して0.5〜1.0μgのをテストするのが最善です。
      2. リポフェクタミン試薬の貯蔵寿命を維持するために、それは可能な限り短い時間のために冷蔵庫から取り出し、使用していないときは、ベンチトップクーラーに配置する必要があります。
         冷蔵庫の合計時間は最小限に抑える必要があります。
2. 室温で5分間チューブをインキュベートします。
3. 脂質チューブにDNAインMEM液を移し、ゆっくりと室温で30分間インキュベートし、ピペットで混ぜる。
4. 25分後、カバースリップを反転する前に、培養神経細胞のディッシュにexcitoxic被害を最小限に抑えるために50mMのキヌレン酸60μLを加える。
   1. 慎重にフリップカバースリップは、足側を上向きにして、滅菌ピンセットを用いて、それらが重複しないように手配する。ニューロンでコーティングされたカバースリップの表面または皿のグリアコーティングされた表面をこすり取るように注意してください。
5. 6cmシャーレから培地の約0.5 mLをとり、軽くチューブにDNAを混ぜ、培地の表面に均一に滴下皿に戻ってDNA溶液を移す。
6. 渦巻きにはない、しかし優しく一方向に前後に料理をスライドさせ、その後、均等にDNA -リポフェクタミン複合体を配布するために垂直方向に停止し、繰り返します。組織培養インキュベーター（37℃、5％CO _2）で90分間インキュベートする。
7. 彼らは重複しないようにフリップカバースリップは、足側のダウン、および手配。式が48時間に一般的に一晩、希望の時間を進行することができます。

パート2：培養海馬神経細胞におけるGFP -タグ付き高密度コア小胞のライブイメージング

機器のセットアップ：

1. 生細胞のイメージングは​​、CCDカメラを装備した蛍光顕微鏡が必要です我々は、ライカの変数を装備したライカDMI 6000B倒立顕微鏡、蛍光灯を使用してください。また、温度コントローラと客観的なヒーターの撮像室がある必須。我々は、ワーナーインスツルメンツRC - 21BRは（カタログ番号TC324B）プラットフォームのヒーターに加えて、直径18mmのカバースリップのために変更（カタログ番号PH2）と温度コントローラを使用してください。チャンバーは開いているポート、チャンバーを注文するときに含めることができる修正が含まれていません。客観的なヒーターは非常にカバースリップの温度を維持し、温度変化によるフォーカスの変化を最小限に抑えることをお勧めします。画像は、買収のドロップインの"ストリーミング"モードを含む、Metamorph（Molecular Devices社）のソフトウェアを使用して、浜松オルカ- ERで取得されています。注 - 我々は全体の顕微鏡を囲む気象室を使用しないでください。このほか、高価とここで説明する短期的なイメージングのための必要はありません。
2. 他の機器と試薬は、作りたてのライブイメージングの培地（1XのCa ²ハンクス⁺およびMg ^{2 +、0.6％}グルコース、および10mMのHEPES）、さらに18 mmのカバーガラス、滅菌ピンセット、非滅菌ピンセット、キムワイプ、真空グリースが含まれています、およびグリースを適用すると注射器（針なし、または変更されたワイドボア針付き）。

手順：

1. （1XのCa ²ハンクス⁺およびMg ^{2 +、0.6％}グルコース、および10mMのHEPES）、新鮮なライブイメージングの培地を準備します。使用しないときに我々は通常^、4℃で、時間と店舗で50mls準備。一度に1週間以内に十分な準備をするのが最善です。約5〜10 mLをニューロンの皿ごとに使用されています。
2. 顕微鏡、カメラ、蛍光灯、および画像集録ソフトウェアを起動します。またチャンバーのプラットフォームと客観のヒーターの電源を入れます。
3. 想像を準備グラムチャンバー。
   1. ワーナーチャンバーは、カバースリップをマウントするためのテフロンインサートが含まれています。永久的なマーカーを含むINSERT"トップ"の操作、ラベル一面の容易さのため。
   2. "トップ"とラベルされたチャンバーの側面に穴を囲む溝にグリースのリングを適用する。それはチャンバーに入ると観察可能な領域を削減するように過剰な使用は避けてください。
   3. 鉗子を使用して、チャンバーの"上"側にきれいな、未使用の18 - cmのカバーを取り付け、チャンバーの凹溝内に密封を作成するには、その端にカバースリップに穏やかな圧力を与える。
   4. チャンバーを裏返しにして、チャンバーの反対側（下）側の溝にグリースの同じようなリングを適用する。
   5. 理想的なチャンバーの所有者である50 - mLのチューブの蓋のアップで、準備室から下側に置きます。
   6. チャンバーにイメージング培地750μLを加える。これは過剰な量ですが、グリースが溢れ出るの培地を防ぐ必要があり、過剰の細胞で覆われたカバースリップが適用されるときにトラップされる気泡を防ぐことができます。
   7. 必要になるまで組織培養インキュベーターで準備室を維持する。イメージング培地が蒸発し、組成物中に変更されるように長時間のインキュベーションは、〜1時間は避けてください。
4. 最終的なチャンバーの組立と生細胞イメージングを実行します。
   1. 準備室やインキュベーターからの組織培養フードにトランスフェクトされたカバースリップの皿を移動します。
   2. 最後のチャンバアセンブリは、細胞を培地にし、℃で連続して37℃で浸漬されたまま確保するために迅速に実行する必要があります。
   3. 滅菌ピンセットを使用して、慎重にトランスフェクトされた皿から一カバーを取り外し、増殖培地を離れて描画するキムワイプにカバースリップの端に触れる。
   4. 準備室の上にカバースリップのニューロンサイドダウン置きます。第一グリースにカバースリップの片側をタッチし、気泡をトラップせずにフラットなカバースリップを持って来るためにエッジの周りの圧力を適用する。過剰イメージング媒体は期待通りにこぼれるでしょう。
   5. 過剰イメージング培地を拭き取ったが、位置からカバーグラスをスライドさせしないように注意してください。
   6. 予備加熱プラットフォームのヒーターにチャンバーを移動し、場所でチャンバーを固定します。
   7. ステージにチャンバーを転送する。
   8. 退色とphotoxicityを減らすために、トランスフェクションされた細胞を見つけるために必要な強度の最小量にランプを調整する。
   9. 低倍率の油浸対物（40倍速）で目的の細胞を見つける。それは右に向かって、最大のスキャンとダウン、、カバースリップの左上の最大のカバースリップのカバレッジを確保するために、冗長な画像の取得、などを避けるために計画された検索パターンに固執することは有益である。
   10. 目的のフィールドが配置された後、高倍率の油浸対物（60〜100倍）に切り替えます。
   11. 蛍光標識タンパク質のダイナミクスの映像を記録する"ストリームの取得"またはイメージングソフトウェアの同等の機能を使用してください。
   12. 後の分析とプレゼンテーションのための位相画像及びその他の付随する画像（例えば可溶性GFP）を取る。
   13. さらにカバーを探索し、次のビデオを記録する前にすべての画像を保存します。
   14. 一般に、1つのカバースリップ3から5のビデオは成功したとみなされます。トランスポートが損傷を受けた細胞で減少すると光毒性と一般的な細胞の健康を心に留めておく必要があります。細胞の健康は、位相差顕微鏡を用いて観察して監視できます。通常は録音はカバースリップあたり約30分間実行されます。

パート3：代表的な結果：

ライブセルイメージング観測は、通常のビュー（図1A）のフィールド内に蛍光タグ付き小器官の動きを示すビデオ（また、画像の"スタック"とも呼ばれる）で構成されています。各ビデオを伴い、しばしば細胞体に関して、タンパク質の発現および/または細胞の健康状態のレベルでの視野の方向を示す画像をサポートしています。輸送のビデオはkymographs（図1B）に形質転換により定量分析を行うことができる。 Kymographsは、各時点がカイモグラフの列で表される行のスキャンを並べることによって粒子の運動を説明する画像です。図2は、反対方向に動いつの粒子がカイモグラフで表現される方法を示しています。 kymographsのさらなる分析は、粒子フラックス、速度、ランレングス、反転、および静止した粒子に関する情報を提供することができます。

図1代表的な生細胞イメージングの観測。mCherryタグ付き組織プラスミノーゲン活性化因子（TPA）輸送の映像から（A）選択されたフレーム。順行性に移動する個々の粒子（緑の矢印）との逆行（赤矢印）の方向が示されている。（B）を説明するKymographsは、TPA - mCherry運動軸索。斜めの線が細胞体から（正のスロープ）または（負勾配）に向かって遠ざかってオルガネラを表してkymographsの水平線は、静止オブジェクトを表します。長い緑と赤の矢印は、（）内の粒子に対応する実行を示しています。微小管脱重合試薬、ノコダゾールによる輸送の変化は、またカイモグラフで示されています。斜め線の有無によって細胞小器官の移動の削減に注意してください。

Discussion

ライブセルイメージングには、培養神経細胞でのオルガネラの輸送の直接観測のための挑戦的な、しかし強力な手法です。困難は、文化の合併症のために貧しい人々のニューロンの健康と手順の上流に起こることができます。したがって、細胞の健康状態は（例については文献4参照）増殖培地で組織培養光顕微鏡を使用中にカバースリップを観察することによってトランスフェクションの前と後に評価されるべきである。イメージングチャンバーにニューロンを含むカバースリップを転送するプロセスは、それゆえに、カバースリップを操作するときに注意を行使することが重要である、細胞にストレスになること。健康そうな顔をしている細胞は手続きの遅れに起因する輸送、またはイメージングメディアの装置または平衡の予熱不完全を表示しないすることが一般的であるができます。輸送解析の軸索と樹状突起の向きは、すなわち順行性と逆行性輸送を区別する、知られている必要があります。したがって、細胞体の位置が決定されていることと、連続神経セグメントが細胞体への関心の領域を接続して見ることができることを確認することが重要です。多くの場合、可溶性GFPの重複する画像を保存、またはinformatively保存されたビデオファイルを命名、"Cell1CellBodyUpperLeft"、など、分析のためのプロセス"の向きを確認するのに十分です。

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
MEM-Eagle with Earle salts and L-glutamine	Reagent	Mediatech, Inc.	10-010-CV
Lipofectamine 2000	Reagent	Invitrogen	11668-027	Transfection reagent
10X Hanks with Ca2+ and Mg2+	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	14185-052	Live-imaging medium
1M HEPES	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	15630-130	Live-imaging medium