Bildproduktion av tät-core Blåsor i Primär Odlade hippocampus nervceller

Summary

Levande cell imaging är av särskild nytta när man studerar dynamiken i organell människohandel. Här beskriver vi ett protokoll för live avbildning av tät-core blåsor i odlade nervceller med hjälp av brett fält fluorescensmikroskopi. Detta protokoll är flexibel och kan anpassas för att bilden andra organeller som mitokondrier, endosomes och peroxisomer.

Abstract

Observera och karakterisera dynamiska cellulära processer kan ge viktig information om cellulär aktivitet som inte kan dras av statiska bilder. Vital fluorescerande prober, särskilt grönt fluorescerande protein (GFP) har revolutionerat cellbiologi härrör från förmågan att märka specifika intracellulära fack och cellstrukturer. Till exempel har den levande avbildning av GFP (och dess spektrala varianter) chimärer tillåtet för en dynamisk analys av cytoskelettet, organell transport och dynamik membran i en mängd organismer och celltyper [1-3]. Även Bildproduktion har blivit vanligare, innebär detta synsätt fortfarande många tekniska utmaningar, särskilt i grundskolor odlade nervceller. En utmaning är ett uttryck för GFP-märkta proteiner i post-mitotiska nervceller, den andra är förmågan att fånga fluorescerande bilder samtidigt minimera fototoxicitet, fotoblekning och upprätthålla allmän cell hälsa. Här ger vi ett protokoll som beskriver en lipid-baserat transfektion metod som ger en relativt låg transfektion skattesats (~ 0,5%), men är idealisk för att avbilda fullständigt polariserade nervceller. En låg transfektion är nödvändigt med så att enda axoner och dendriter kan karakteriseras som till sin läggning till cellkroppen att bekräfta riktning av transport, dvs anterograd v. retrograd. Vår syn på bildbehandling GFP uttrycka nervceller bygger på en standard brett fält fluorescerande mikroskop utrustad med en CCD-kamera, bildbehandlingsprogrammet, och en uppvärmd avbildning kammare. Vi har avbildat ett brett utbud av organeller eller strukturer, till exempel tät-core blåsor, mitokondrier, koner tillväxt och aktin utan några särskilda optiken eller krav excitation annat än en fluorescerande ljuskälla. Dessutom kan spektralt-distinkt, fluorescerande proteiner, till exempel, GFP och dsRed-märkta proteiner, visualiseras i närheten samtidigt för att karakterisera samarbete transport eller andra samordnade cellulära händelser. Den avbildningsteknik som beskrivs här är flexibel för olika bildprogram och kan antas av ett laboratorium för relativt liten kostnad som ett mikroskop är tillgänglig.

Protocol

Del 1: transfektion av nervceller med hjälp av Lipofectamine 2000 (Invitrogen)

Utrustning set-up:

Råtta eller mus hippocampus nervceller odlas enligt Kaech och Bankiren, 2006 [4]. Den typiska celltäthet används för transfections är 250 tusen cells/6-cm maträtt. Nödvändiga reagens och utrustning inkluderar 50 mM kynurensyra, vanlig bänk rörhållare, en bänk kylare (bäst att hålla Lipofectamine reagens kallt),
Lipofectamine reagens, MEM, mikrofugrör rör, micropipetters och steril tång.

Förfarande:

1. För varje transfektion etikett två 1,5 ml rör, ett att innehålla plasmid-DNA, en att innehålla transfektion reagens. Följande inkubationer kan ske i rumstemperatur.
   1. Kombinera 1,0 mikrogram av plasmid-DNA med 100 mikroliter MEM i ett rör (utan tillägg av något slag, MEM behöver inte vara temperaturen i pH-jämvikt).
   2. Kombinera 6,0 mikroliter Lipofectamine med 100 mikroliter MEM i den andra 1,5 ml rör.
      1. Inga justeringar för dubbel transfections krävs även om Lipofectamine: kommer DNA förhållandet att halveras i sådana fall. Förhållandet Lipofectamine: DNA är fortfarande inom tillverkarens förslag. Det är bäst att testa 0,5-1,0 mikrogram för varje plasmid för optimal uttryck.
      2. För att bevara hållbarheten i Lipofectamine reagens, bör den tas bort ur kylskåpet så kort tid som möjligt och placeras i en bänk svalare när den inte används.
         Total tid ur kylskåpet bör hållas till ett minimum.
2. Inkubera rören i 5 minuter vid rumstemperatur.
3. Överför DNA-i-MEM-lösning i lipid röret och blanda försiktigt med pipett, sedan inkubera i 30 minuter vid rumstemperatur.
4. Efter 25 minuter innan vändning täckglas, lägg till 60 mikroliter av 50 mm kynurensyra att minimera excitoxic skador på fat odlade nervceller.
   1. Vänd försiktigt täckglas fot-side-up med hjälp av steril pincett och ordna så att de inte överlappar varandra. Var noga med att inte skrapa neuron-belagda yta täckglas eller Glia-belagda ytan av skålen.
5. Ta cirka 0,5 ml medium från 6-cm skål och blanda försiktigt med DNA i röret, överför DNA-lösningen tillbaka till skålen droppande jämnt på ytan av mediet.
6. Inte snurra, men försiktigt glida skålen fram och tillbaka i en riktning, sedan sluta och upprepa i vinkelrät riktning att fördela DNA-Lipofectamine komplex. Inkubera i 90 minuter i vävnadsodling inkubatorn (37 ° C, 5% CO _2).
7. Flip täckglas fot-och-ner, och ordna så att de inte överlappar varandra. Låt uttryck för att gå vidare till önskad tid, vanligen under natten till 48 timmar.

Del 2: Live avbildning av GFP-märkta tät-core blåsor i odlade hippocampus neuroner

Utrustning set-up:

1. Avbildning av levande celler kräver en fluorescensmikroskop utrustad med en CCD-kamera, vi använder en Leica DMI 6000B inverterat mikroskop utrustad med Leica variabeln lysrör. Dessutom krävs en avbildning kammare med temperaturkontroll och en objektiv värmare. Vi använder Warner Instrument RC-21BR modifierats för en 18-mm täckglas förutom en plattform värmare (kat. # PH2) och temperatur regulator (kat. # TC324B). Kammaren innehåller inga öppna portar, en förändring som kan ingå vid beställning kammaren. En objektiv värmare rekommenderas starkt att bidra till att upprätthålla temperaturen på täckglas och minimera förändringar i fokus på grund av temperaturförändringar. Bilderna förvärvas med en Hamamatsu Orca-ER hjälp av metamorfa (Molecular Devices) programvara, inklusive "streaming"-läge för förvärv drop-in. OBS-Vi använder inte en klimatkammare som omsluter hela mikroskop. Detta tillägg är dyr och inte nödvändigt för den kortsiktiga avbildning beskrivs här.
2. Annan utrustning och reagenser innehåller nytillagade Bildproduktion medium (1X Hanks med Ca ^{2 +} och Mg ^{2 +,} 0,6% glukos, och 10 mm HEPES), ytterligare 18 mm täckglas glas, steril pincett, icke-steril tång, Kimwipes, vakuum fett , och en spruta (utan nål, eller med modifierad bred nål) som man kan använda fett.

Förfarande:

1. Bered en färsk Bildproduktion medium (1X Hanks med Ca ^{2 +} och Mg ^{2 +,} 0,6% glukos, och 10 mm HEPES). Vi förbereder typiskt 50mls åt gången och förvara vid 4 ^° C när den inte används. Det är bäst att förbereda sig tillräckligt för mer än en vecka i taget. Cirka 5-10 ml används per fat nervceller.
2. Start mikroskop, kamera, lysrör och bild förvärv programvara. Även slå på strömmen till kammaren plattformen och värmare mål.
3. Förbered föreställag kammare.
   1. Warner kammaren innehåller en Teflon insats för montering av täckglas. För att underlätta manipulation, etikett ena sidan av skäret "toppen" med en permanent märkpenna.
   2. Applicera en ring av fett i spåret runt hål i sidan av kammaren märkt "toppen". Undvik att använda överskott eftersom det kommer in i kammaren och minska observerbara området.
   3. Använd pincett, bifoga en ren, oanvänd 18-cm täckglas till "toppen" sidan av kammaren, försiktigt tryck på täckglas vid kanterna för att skapa en tät försegling i det nedsänkta spåret i kammaren.
   4. Vänd kammaren över och tillämpa en liknande ring av fett i spåret på den motsatta (botten) sidan av kammaren.
   5. Placera förberedda kammare botten uppåt-på locket till en 50-ml tub, som är en idealisk kammare innehavare.
   6. Tillsätt 750 mikroliter för bildframställning medium till kammaren. Detta är en överdriven mängd, men fettet bör förhindra medium spiller över och överskottet kommer att bidra till att förhindra bubblor i kläm när cellen täckta täckglas tillämpas.
   7. Behåll den förberedda kammare i vävnadsodling inkubatorn tills det behövs. Långvarig inkubationer bör ~ 1 timme undvikas eftersom imaging medel avdunstar och förändring i sammansättningen.
4. Utför den sista kammaren montering och levande cell imaging.
   1. Flytta förberedda kammare och ett fat med transfekterade täckglasen från inkubatorn till vävnadsodling huven.
   2. Den slutliga kammaren församling bör ske snabbt för att säkerställa att cellerna kvar nedsänkt i medium och vid 37 ° C kontinuerligt.
   3. Använda steril tång försiktigt ta bort ett täckglas från transfekterade skålen, rör vid kanten av täckglaset till en Kimwipe att dra iväg tillväxt medium.
   4. Placera täckglas neuron-och-ner på den förberedda kammare. Tryck på ena sidan av täckglas till fett först och utöva påtryckningar runt kanterna för att få täckglas platt utan att fånga bubblor. Överskott imaging medium kommer komma ut som förväntat.
   5. Torka bort överflödigt bildbehandling medium, men var noga med att inte skjut täckglasen ur position.
   6. Flytta kammaren till förvärmd plattform värmare och fäst kammaren på plats.
   7. Överför kammaren till scenen.
   8. För att minska fotoblekning och photoxicity, justera lampan till den minsta intensitet som krävs för att hitta transfekterade cellerna.
   9. Hitta en cell av intresse med en låg förstoring olja mål (40X). Det är fördelaktigt att hålla sig till en planerad sökmönster för att säkerställa maximal täckglas täckning och för att undvika överflödig bild förvärv, t.ex. upp till vänster på täckglas, skanning upp och ner som arbetar till höger.
   10. Växla till en hög förstoring olja objektiv (60-100x) en gång önskat fält har hittats.
   11. Använd "stream förvärv" eller liknande funktion i ditt bildbehandlingsprogram för att spela in en video av fluorescerande-märkta proteinet dynamik.
   12. Ta en fas bilder och alla andra medföljande bilder (t.ex. Löslig GFP) för senare analys och presentation.
   13. Spara alla bilder innan utforska täckglas ytterligare och spelar in nästa video.
   14. Normalt 3-5 videoklipp från ett täckglas anses vara framgångsrik. Fototoxicitet och allmän cell hälsa bör hållas i åtanke när transporter minskas i skadade celler. Cell hälsa kan övervakas genom observation med hjälp av fas mikroskopi. Normalt inspelningar görs under cirka 30 minuter per täckglas.

Del 3: representativa resultat:

Levande cell imaging observationer består typiskt av videofilmer (även känd som "stackar" av bilder) som visar flödet av fluorescerande-taggade organeller inom synfältet (Figur 1A). Åtföljer varje video är ofta stödjer bilder som illustrerar inriktningen på synfältet i förhållande till cellkroppen, halt av protein uttryck och / eller hälsa cellen. Videor av transporter kan bli föremål för kvantitativ analys genom ombildning till kymographs (Figur 1B). Kymographs är bilder som illustrerar partikel rörelsen genom juxtaposing linje skannar där varje tidpunkt representeras av en kolumn i kymograph. Figur 2 visar hur två partiklar som rör sig i motsatt riktning är representerade i en kymograph. Ytterligare analys av kymographs kan ge information om partikelflöde, hastighet, kör längd, återföringar och stationära partiklar.

Figur 1. Representant levande cell imaging observationer. (A) markerade bildrutor från en video av mCherry taggade vävnadsplasminogenaktivator (TPA) transporter. Enskilda partiklar som rör sig i anterograd (gröna pilar) och retrograd (röda pilar) riktningar är indicerat. (B) Kymographs illustrerar TPA-mCherry rörelse iAxon. Horisontella linjer i kymographs representerar stillastående objekt, medan diagonala linjerna representerar organeller på väg bort från (positiv lutning) eller mot (negativ lutning) cellkroppen. Den långa gröna och röda pilar visar kör motsvarande partiklar i (A). Förändringar i transporten på grund av mikrotubuli depolymerizing reagens, nocodazole, är också illustrerad med ett kymograph. Notera minskningen av rörliga organeller av frånvaron av diagonala linjer.

Discussion

Levande cell imaging är en utmanande, men kraftfull teknik för direkt observation av organell transporter i odlade nervceller. Svårigheter kan uppstå före förfarandet med dålig neuron hälsa på grund av kultur komplikationer. Därför bör cell hälsa (för exempel se ref. 4) bedömas före och efter transfektion genom att observera täckglasen medan tillväxten mediet med hjälp av en vävnad mikroskop kultur ljus. Processen att överföra neuron innehåller täckglasen till avbildning kammaren kan vara stressigt till cellerna, därför är det viktigt att iaktta försiktighet när manipulera täckglas. Det kan vara gemensamma för friskare celler för att visa inga transporter på grund av förseningar i förfarandet, eller ofullständig förvärmning av utrustning eller jämvikt av avbildning media. För transport analys axonal och dendritiska orientering måste vara känd, dvs skilja anterograd och retrograd transport. Det är därför viktigt att vara säker på att platsen för en cell kroppen bestäms och att en kontinuerlig neuronala segment kan ses som förbinder regionen av intresse för cellkroppen. Ofta sparar överlappande bilder av lösliga GFP eller informativt namnge den sparade videofiler, är tillräcklig för att fastställa de processer "orientering för analyser, t.ex." Cell1CellBodyUpperLeft ".

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
MEM-Eagle with Earle salts and L-glutamine	Reagent	Mediatech, Inc.	10-010-CV
Lipofectamine 2000	Reagent	Invitrogen	11668-027	Transfection reagent
10X Hanks with Ca2+ and Mg2+	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	14185-052	Live-imaging medium
1M HEPES	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	15630-130	Live-imaging medium