Imágenes en vivo del denso núcleo de vesículas en la Primaria neuronas del hipocampo cultivadas

Summary

Imágenes de células vivas es de particular utilidad en el estudio de la dinámica del tráfico de orgánulos. A continuación se describe un protocolo para obtener imágenes en vivo de alta densidad de núcleo vesículas en las neuronas cultivadas con amplio campo de la microscopía de fluorescencia. Este protocolo es flexible y puede adaptarse a los orgánulos de imagen como las mitocondrias, endosomas, y peroxisomas.

Abstract

La observación y la caracterización dinámica de los procesos celulares pueden dar información importante sobre la actividad celular que no se puede obtener a partir de imágenes estáticas. Vital sondas fluorescentes, especialmente proteína fluorescente verde (GFP) ha revolucionado la biología celular derivada de la capacidad de etiqueta específica compartimentos intracelulares y las estructuras celulares. Por ejemplo, la imagen en vivo de las buenas prácticas agrarias (y sus variantes espectral) quimeras han permitido un análisis dinámico del citoesqueleto, orgánulos de transporte, y la dinámica de la membrana en una multitud de organismos y tipos de células [1-3]. A pesar de imagen en vivo se ha convertido en frecuente, este enfoque también plantea muchos problemas técnicos, sobre todo en primaria neuronas cultivadas. Uno de ellos es la expresión de las buenas prácticas agrarias de etiquetado proteínas en las neuronas post-mitóticas, y el otro es la capacidad de capturar imágenes fluorescentes y reducir al mínimo la fototoxicidad, photobleaching, y mantener la salud celular en general. Aquí les ofrecemos un protocolo que describe un método de transfección basado en lípidos que produce una tasa de transfección relativamente baja (~ 0,5%), sin embargo, es ideal para la proyección de imagen de las neuronas totalmente polarizada. Una baja tasa de transfección es esencial para que los axones y las dendritas solo puede ser caracterizado en cuanto a su orientación hacia el cuerpo celular para confirmar la direccionalidad del transporte, es decir, anterógrada v. retrógrada. Nuestro enfoque de la imagen de las neuronas que expresan GFP se basa en un estándar de campo amplio microscopio de fluorescencia equipado con una cámara CCD, software de captura de imágenes, y una cámara de imágenes calientes. Hemos fotografiado una amplia variedad de organelos o estructuras, por ejemplo, denso núcleo de las vesículas, los conos de la mitocondria, el crecimiento y la actina sin ningún tipo de óptica o requisitos especiales de excitación que no sea una fuente de luz fluorescente. Además, espectralmente diferentes, las proteínas de la etiqueta fluorescente, por ejemplo, las buenas prácticas agrarias y de las proteínas dsRed con etiquetas, se puede visualizar al mismo tiempo cerca de caracterizar el transporte co-u otros eventos celulares coordinada. El enfoque de imagen se describe aquí es flexible para una variedad de aplicaciones de imagen y pueden ser adoptadas por un laboratorio de un costo relativamente bajo un microscopio siempre está disponible.

Protocol

Parte 1: La transfección de las neuronas con Lipofectamine 2000 (Invitrogen)

Instalación del equipo:

Las neuronas del hipocampo de rata o ratón se cultivaron de acuerdo con Kaech y Banker, 2006 [4]. La densidad celular típico utilizado para transfecciones es de 250.000 cells/6-cm plato. Reactivos y equipos necesarios son 50 mM de ácido quinurénico, titular regular de tubo de laboratorio, un enfriador de sobremesa (el mejor para mantener fríos los reactivos Lipofectamine),
Reactivo Lipofectamine, MEM, tubos de microcentrífuga, micropipetters y pinzas estériles.

Procedimiento:

1. Para cada etiqueta de transfección dos tubos de 1,5 ml, una para contener el ADN del plásmido, que contiene un reactivo de transfección. Las incubaciones siguiente puede proceder a temperatura ambiente.
   1. Combine 1,0 mg de ADN de plásmido con 100 l MEM en un tubo (sin extras de ningún tipo; MEM no tiene por qué ser la temperatura del pH equilibrado).
   2. Combine 6,0 l con 100 Lipofectamine MEM l en el tubo de 1,5 mL otros.
      1. No se requieren ajustes para transfecciones dobles son requeridos a pesar de que la Lipofectamine: relación de ADN se reduce a la mitad en estos casos. La relación de Lipofectamine: El ADN es todavía dentro de la propuesta del fabricante. Lo mejor es probar 0,5-1,0 mg por cada plásmido para la expresión óptima.
      2. Para preservar la vida útil del reactivo Lipofectamine, hay que sacar de la nevera durante el menor tiempo posible y se coloca en una nevera portátil de sobremesa, cuando no esté en uso.
         Tiempo total del refrigerador debe mantenerse al mínimo.
2. Incubar los tubos durante 5 minutos a temperatura ambiente.
3. La transferencia de la solución de ADN en el MEM en el tubo de lípidos, y mezcle suavemente con una pipeta, a continuación, se incuba durante 30 minutos a temperatura ambiente.
4. Después de 25 minutos, antes de mover de un tirón cubreobjetos, se añaden 60 l de 50 mM de ácido quinurénico para minimizar el daño excitoxic al plato de las neuronas cultivadas.
   1. Cubreobjetos con cuidado voltear los pies de arriba abajo, usando pinzas esterilizadas, y arreglar lo que no se superpongan. Tenga cuidado de no raspar la superficie de las neuronas del cubreobjetos recubiertos o la superficie de las células de revestimiento, de la antena.
5. Tome aproximadamente 0,5 mL de medio de la antena de 6 cm y mezcle suavemente con el ADN en el tubo, la transferencia de la solución de ADN de vuelta a la fuente que gotea de manera uniforme sobre la superficie del medio.
6. No remolino, pero deslice suavemente plato de ida y vuelta en una dirección, y luego se detiene y repite en la dirección perpendicular a distribuir uniformemente los complejos ADN-Lipofectamine. Incubar durante 90 minutos en el incubador de cultivo de tejidos (37 ° C CO, 5% _2).
7. Cubreobjetos voltear los pies, boca abajo, y arreglar lo que no se superpongan. Permitir la expresión de proceder durante el tiempo deseado, por lo general durante la noche a 48 horas.

Parte 2: imágenes en vivo de la GFP-etiquetados denso núcleo de vesículas en cultivos de neuronas del hipocampo

Instalación del equipo:

1. Imágenes de células vivas requiere un microscopio de fluorescencia equipado con una cámara CCD, se utiliza un microscopio Leica DMI 6000B invertido equipado con la variable de Leica, una lámpara fluorescente. También se requiere una cámara de imágenes con el controlador de temperatura y un calentador de objetivo. Usamos la Warner Instrumentos RC-21BR modificado para un cubreobjetos de 18 mm, además de un calentador de la plataforma (cat. # PH2) y el controlador de temperatura (cat. # TC324B). La cámara no contiene los puertos abiertos, una modificación que se pueden incluir en el pedido de la cámara. Un calentador objetivo es muy recomendable para ayudar a mantener la temperatura del cubreobjetos y minimizar los cambios de enfoque, debido a las fluctuaciones de temperatura. Las imágenes se adquieren con un Hamamatsu Orca-ER con Metamorph (Molecular Devices) de software, incluyendo el 'streaming' modo de adquisición de drop-in. Nota-No utilizamos una cámara climática que encierra todo el microscopio. Esto además es caro y no es necesario para la proyección de imagen a corto plazo se describe aquí.
2. Otros equipos y reactivos son recién preparados medio de imágenes en vivo (1X Hanks con Ca ^{2 +} y Mg ^{2 +,} glucosa 0,6%, y HEPES 10 mM), más de 18 mm cubreobjetos de vidrio, pinzas estériles, pinzas sin esterilizar, Kimwipes, grasa de vacío , y una jeringuilla (sin aguja, o con modificación de grueso calibre de aguja) con el que aplicar grasa.

Procedimiento:

1. Prepare un nuevo medio de imágenes en vivo (1X Hanks con Ca ^{2 +} y Mg ^{2 +,} glucosa 0,6%, y HEPES 10 mM). Por lo general 50mls preparar a la vez y se almacenan a 4 ^º C cuando no estén en uso. Lo mejor es preparar lo suficiente para no más de una semana a la vez. Ml aproximadamente 5-10 se utilizan por plato de las neuronas.
2. Inicio microscopio, cámara, lámparas fluorescentes, y el software de adquisición de imágenes. También a su vez en el poder a la plataforma de la cámara y calentadores objetivo.
3. Preparar el imaginarg cámara.
   1. La cámara de Warner incluye una ranura de teflón para el montaje de cubreobjetos. Para facilitar la manipulación, la etiqueta de un lado de la inserción "de arriba" con un marcador permanente.
   2. Aplicar un anillo de grasa en el surco que rodea el agujero en el lado de la cámara con la etiqueta "top". Evite el uso de exceso, ya que entrarán en la cámara y reducir el área observable.
   3. Con unas pinzas, coloque un paño limpio y sin usar de 18 cm cubreobjetos a la "top" de la cámara, presione suavemente el cubreobjetos en sus bordes para crear un sello hermético en la hundida de la cámara.
   4. A su vez la cámara y aplicar más de un anillo similar de grasa a la ranura en el lado opuesto (inferior) de la cámara.
   5. Coloque el preparado de cámara inferior hacia arriba-en la tapa de un tubo de 50 ml, que es un soporte de cámara ideal.
   6. Añadir 750 l de medio de imágenes de la cámara. Esta es una cantidad excesiva, pero la grasa debe evitar que el medio se extienda y el exceso de ayudar a prevenir burbujas de ser atrapados cuando el cubreobjetos células cubiertas se aplica.
   7. Mantener la cámara preparada en la incubadora de cultivo de tejidos hasta que se necesite. Incubación prolongada, aproximadamente 1 hora se debe evitar como medio de imágenes se evaporará y el cambio en la composición.
4. Realizar el montaje final y la cámara de imágenes de células vivas.
   1. Mueve la cámara preparada y un plato de cubreobjetos transfectadas de la incubadora a la campana de cultivo de tejidos.
   2. El conjunto de la cámara final debe realizarse con rapidez para garantizar que las células permanecen inmersos en el medio y en 37 ° C de forma continua.
   3. Usando una pinza estéril, retirar con cuidado un portaobjetos de la antena transfectadas, tocar el borde del cubreobjetos a un Kimwipe para arrastrar medio de cultivo.
   4. Coloque el cubreobjetos neurona boca abajo en la cámara preparada. Tocar un lado del cubreobjetos a la grasa primero y aplique presión alrededor de los bordes para que el cubreobjetos planos sin burbujas de captura. Medio de imágenes exceso se derrame como se esperaba.
   5. Limpie el exceso de medio de imágenes, pero tenga cuidado de no rozar con los cubreobjetos de su posición.
   6. Mueve la cámara del calentador de la plataforma pre-calentado y sujetar la cámara en su lugar.
   7. La transferencia de la cámara a la escena.
   8. Para reducir photobleaching y photoxicity, ajustar la luz a la cantidad mínima de intensidad necesaria para encontrar las células transfectadas.
   9. Encontrar una célula de interés con un objetivo de aumento del petróleo baja (40X). Es beneficioso para mantenerse dentro de un patrón de búsqueda planificada para asegurar una cobertura máxima cubreobjetos y evitar adquisiciones redundantes imagen, a la izquierda, por ejemplo, la parte superior de cubreobjetos, escaneo de arriba a abajo de trabajo a la derecha.
   10. Cambiar a un objetivo de aumento del petróleo (60-100x) una vez al campo deseado ha sido localizado.
   11. Use la "adquisición stream" o función similar de su software de imagen para grabar un video de la dinámica de la proteína fluorescente marcado.
   12. Toma una imagen de fase y cualquier otra imagen que acompaña (GFP soluble, por ejemplo) para su posterior análisis y presentación.
   13. Guardar todas las imágenes antes de explorar el cubre más y la grabación del video a continuación.
   14. Típicamente 3-5 videos de un cubreobjetos se considera correcta. Fototoxicidad y salud de las células en general debe tener en cuenta que el transporte se reduce en las células dañadas. Salud de las células pueden ser monitoreados mediante observación con microscopio de fase. Normalmente, las grabaciones se llevan a cabo durante aproximadamente 30 minutos por tapar.

Parte 3: Resultados del representante:

Observaciones en vivo de imágenes de células normalmente consisten en videos (también conocido como "pilas" de las imágenes) que muestran el movimiento de los orgánulos marcados con fluorescencia en el campo de visión (fig. 1A). Que acompañan a cada vídeo son a menudo el apoyo a las imágenes que ilustran la orientación del campo de vista con respecto al cuerpo celular, el nivel de expresión de la proteína y / o la salud de la célula. Vídeos de transporte pueden ser sometidos a un análisis cuantitativo de la transformación de kymographs (fig. 1B). Kymographs son imágenes que ilustran el movimiento de partículas mediante la yuxtaposición de líneas de barrido que se representa cada punto del tiempo por una columna en el quimógrafo. La figura 2 muestra cómo dos partículas que se mueven en dirección opuesta se representan en un quimógrafo. Un análisis más detallado de kymographs puede proporcionar información sobre el flujo de partículas, la velocidad, la longitud de ejecución, las inversiones, y las partículas fijas.

Figura 1. Representante en vivo Observaciones celular de imágenes. (A) los fotogramas seleccionados de un vídeo de mCherry etiquetados con activador tisular del plasminógeno (TPA) de transporte. Las partículas individuales se mueven en la anterógrada (flechas verdes) y retrógrada (flechas rojas) se indican las instrucciones. (B) ilustra Kymographs TPA-mCherry movimiento en elaxón. Las líneas horizontales en kymographs representan objetos fijos, mientras que las líneas diagonales representan orgánulos alejarse de (pendiente positiva) o hacia (pendiente negativa) del cuerpo celular. Las largas flechas verdes y rojas muestran las carreras correspondientes a las partículas en (A). Cambios en el transporte debido a que el reactivo despolimerización de microtúbulos, nocodazole, también se ilustra con un quimógrafo. Tenga en cuenta la reducción de los orgánulos en movimiento por la ausencia de líneas en diagonal.

Discussion

Imágenes de células vivas es una técnica difícil, pero de gran alcance para la observación directa de transporte de orgánulos en las neuronas cultivadas. Pueden surgir dificultades aguas arriba del procedimiento con la salud neuronal pobres debido a las complicaciones cultura. Por lo tanto, la salud celular (para ejemplos, ver ref. 4) deben ser evaluados antes y después de la transfección mediante la observación de los cubreobjetos, mientras que en medio de crecimiento con un cultivo de tejidos microscopio de luz. El proceso de transferencia de las neuronas que contienen cubreobjetos a la cámara de imágenes puede ser estresante para las células, por lo tanto es importante tener cuidado al manipular el cubreobjetos. Que puede ser común para las células de aspecto saludable que no muestran el transporte debido a los retrasos en el procedimiento, o incompleta de pre-calentamiento de los equipos o el equilibrio de los medios de comunicación de imágenes. Para el análisis de la orientación de transporte axonal y dendrítica debe ser conocido, es decir, distinguir el transporte anterógrado y retrógrado. Por ello es esencial para asegurarse de que la ubicación de un cuerpo celular está determinado y que un segmento neuronal continua se puede ver la conexión de la región de interés para el cuerpo de la célula. Ahorrando a menudo se superponen imágenes de las buenas prácticas agrarias soluble, o informativamente el nombre del archivo de vídeo guardado, es suficiente para determinar la orientación de los procesos "para los análisis, por ejemplo," Cell1CellBodyUpperLeft ".

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
MEM-Eagle with Earle salts and L-glutamine	Reagent	Mediatech, Inc.	10-010-CV
Lipofectamine 2000	Reagent	Invitrogen	11668-027	Transfection reagent
10X Hanks with Ca2+ and Mg2+	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	14185-052	Live-imaging medium
1M HEPES	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	15630-130	Live-imaging medium