Immagini dal vivo di Dense-core Vescicole nella Primaria neuroni coltivati ​​ippocampale

Summary

L'imaging cellulare Live è di particolare utilità quando si studiano le dinamiche del traffico di organelli. Qui si descrive un protocollo per l'imaging dal vivo di denso-core vescicole in neuroni coltivati ​​con grande campo microscopia a fluorescenza. Questo protocollo è flessibile e può essere adattato a organelli altra immagine come i mitocondri, endosomi e perossisomi.

Abstract

L'osservazione e la caratterizzazione dinamica dei processi cellulari può fornire informazioni importanti sulle attività cellulare che non possono essere acquisite immagini statiche. Vital sonde fluorescenti, in particolare proteina fluorescente verde (GFP) hanno rivoluzionato la biologia delle cellule che derivano dalla capacità di etichetta specifici comparti intracellulari e strutture cellulari. Per esempio, l'immagine dal vivo di GFP (e le sue varianti spettrale) chimere hanno permesso un'analisi dinamica del citoscheletro, il trasporto degli organelli, e le dinamiche della membrana in una moltitudine di organismi e di tipi di cellule [1-3]. Sebbene l'imaging dal vivo è diventata prevalente, questo approccio pone ancora molti problemi tecnici, in particolare nella scuola primaria neuroni coltivati. Una sfida è l'espressione di proteine ​​GFP-tagged in post-mitotico neuroni, l'altro è la capacità di catturare immagini a fluorescenza, riducendo al minimo fototossicità, photobleaching, e mantenere la salute generale delle cellule. Qui forniamo un protocollo che descrive un metodo a base di lipidi transfezione che produce un tasso di trasfezione relativamente basso (~ 0,5%), è tuttavia ideale per l'imaging di neuroni completamente polarizzata. Un tasso di trasfezione basso è essenziale in modo che gli assoni e dendriti singolo può essere caratterizzato da loro orientamento verso il corpo cellulare per confermare la direzionalità di trasporto, cioè, anterograda v. retrograda. Il nostro approccio all'imaging GFP che esprimono i neuroni si basa su uno standard a grande campo microscopio a fluorescenza equipaggiato con una telecamera CCD, software per la cattura delle immagini, e una camera di imaging riscaldata. Abbiamo immaginato una grande varietà di organelli o strutture, ad esempio, densi-core vescicole, mitocondri, coni di crescita, e actina senza ottica o esigenze particolari di eccitazione che non sia un fonte di luce fluorescente. Inoltre, spettralmente-distinte, proteine ​​fluorescente, ad esempio, GFP-tagged DsRed e proteine, possono essere visualizzati simultaneamente vicino a caratterizzare co-trasporto o altri eventi coordinati cellulare. L'approccio di imaging qui descritto è flessibile per una varietà di applicazioni di imaging e può essere adottata da un laboratorio per il costo relativamente poco fornito un microscopio è disponibile.

Protocol

Parte 1: Transfection dei neuroni utilizzando Lipofectamine 2000 (Invitrogen)

Attrezzature di set-up:

Neuroni dell'ippocampo di ratto o il mouse sono coltivate secondo Kaech e banchiere, 2006 [4]. La densità tipica cellula usata per trasfezioni è di 250.000 piatto cells/6-cm. Reagenti necessari e le attrezzature includono 50 acido kynurenic mM, regolare titolare tubo da banco, un dispositivo di raffreddamento da banco (meglio per mantenere freddo Lipofectamine reagenti),
Reagente Lipofectamine, MEM, tubi microcentrifuga, micropipetters e pinza sterile.

Procedimento:

1. Per ogni etichetta trasfezione due provette da 1,5 ml, uno per contenere il DNA plasmidico, uno per contenere i reagenti di trasfezione. Le incubazioni seguenti possono avvenire a temperatura ambiente.
   1. Combina 1,0 mg di DNA plasmidico con 100 microlitri MEM in una provetta (senza supplementi di qualsiasi tipo; MEM non ha bisogno di essere temperatura di pH equilibrato).
   2. Combina 6,0 microlitri Lipofectamine con 100 microlitri MEM negli altri 1,5 ml tubo.
      1. Nessuna rettifica per trasfezioni doppie sono necessari anche se la Lipofectamine: rapporto di DNA saranno dimezzati in questi casi. Il rapporto tra Lipofectamine: il DNA è ancora entro il suggerimento del produttore. E 'meglio verificare 0,5-1,0 mg per ogni plasmide per l'espressione ottimale.
      2. Per preservare la durata di conservazione del reattivo Lipofectamine, dovrebbe essere rimosso dal frigorifero per il minor tempo possibile e posto in un dispositivo di raffreddamento da banco, quando non in uso.
         Tempo totale dal frigorifero dovrebbe essere ridotto al minimo.
2. Incubare le provette per 5 minuti a temperatura ambiente.
3. Trasferire il DNA in-MEM soluzione nel tubo di lipidi, e mescolare delicatamente con una pipetta, poi incubare per 30 minuti a temperatura ambiente.
4. Dopo 25 minuti, prima coprioggetto flipping, aggiungere 60 ml di 50 mM acido kynurenic per minimizzare i danni excitoxic al piatto di neuroni in coltura.
   1. Coprioggetto con attenzione capovolgere piedi-side-up con pinza sterile, e organizzare in modo che non si sovrappongano. Fare attenzione a non grattare il neurone rivestita superficie del vetrino o la glia rivestita superficie del piatto.
5. Di circa 0,5 ml di mezzo dai 6 cm piatto e mescolare delicatamente con il DNA in provetta, trasferire la soluzione di DNA di nuovo al piatto gocciolamento in modo uniforme sulla superficie del terreno.
6. Non turbolenza, ma dolcemente scivolare piatto avanti e indietro in una direzione, poi fermarsi e ripetere in direzione perpendicolare a distribuire uniformemente il DNA Lipofectamine complessi. Incubare per 90 minuti nel tessuto culturale incubatore (37 ° C, 5% CO _2).
7. Flip copri-piedi-side-down, e organizzare in modo che non si sovrappongano. Consenta loro di esprimere a procedere per il tempo desiderato, di solito durante la notte per 48 ore.

Parte 2: immagini dal vivo di GFP-tagged densi-core vescicole in colture di neuroni dell'ippocampo

Attrezzature di set-up:

1. Imaging di cellule vive richiede un microscopio a fluorescenza dotato di una fotocamera CCD, usiamo un microscopio invertito Leica DMI 6000B equipaggiato con la variabile Leica, lampada fluorescente. C'è bisogno anche di una camera di imaging con regolatore di temperatura e un riscaldatore obiettivo. Usiamo il Warner Instruments RC-21BR modificato per un 18 mm coprioggetto oltre ad un riscaldatore piattaforma (cat. # PH2) e controllo della temperatura (cat. # TC324B). La camera non contiene le porte aperte, una modifica che può essere incluso al momento dell'ordine della camera. Un riscaldatore obiettivo è altamente consigliato per aiutare a mantenere la temperatura del coprioggetto e minimizzare le modifiche a fuoco a causa di fluttuazioni di temperatura. Le immagini sono acquisite con un Hamamatsu Orca-ER utilizzando Metamorph (Molecular Devices), software, tra cui la modalità 'streaming' di acquisizione drop-in. Nota-Non usiamo una camera climatica che racchiude l'intero microscopio. Tale aggiunta è costosa e non necessaria per il breve termine di imaging descritto qui.
2. Altre attrezzature e reagenti sono appena terreno preparato immagini dal vivo (1X Hanks con Ca ^{2 +} e Mg ^{2 +,} glucosio 0,6%, e HEPES 10mM), ulteriori 18 mm coprioggetto di vetro, pinza sterile, non sterile pinze, Kimwipes, grasso vuoto , e una siringa (senza ago o con modificato ampio tunnel ago) con cui ingrassare.

Procedimento:

1. Preparare fresca medio vivere per immagini (1X Hanks con Ca ^{2 +} e Mg ^{2 +,} glucosio 0,6%, e HEPES 10mM). Noi di solito preparare 50mls alla volta e conservare a 4 ^° C quando non in uso. La cosa migliore è prepararsi a sufficienza per non più di una settimana alla volta. ML circa 5-10 vengono utilizzati per ogni piatto di neuroni.
2. Avviare microscopio, macchina fotografica, lampada fluorescente, e acquisizione di software immagine. Anche accendere alla piattaforma da camera e riscaldatori obiettivo.
3. Preparare la immaginag camera.
   1. La camera di Warner include un inserto in teflon per il montaggio di coprioggetto. Per la facilità di manipolazione, etichetta un lato della "top" inserire con un pennarello indelebile.
   2. Applicare un anello di grasso al solco che circonda il buco nel lato della camera etichetta "top". Evitare di utilizzare l'eccesso come sarà entrare nella camera e ridurre l'area osservabile.
   3. Utilizzando pinze, allegare un ambiente pulito, inutilizzati da 18 centimetri coprioggetto al lato "top" della camera, applicare una leggera pressione al coprioggetto ai bordi per creare una perfetta tenuta nel solco incasso della camera.
   4. Girare la camera di sopra e applicare un anello simile di grasso nella scanalatura sul lato opposto (in basso) lato della camera.
   5. Mettere il preparato camera-basso verso l'alto, sul coperchio di un tubo da 50 ml, che è un titolare camera ideale.
   6. Aggiungere 750 ml di medium di imaging per la camera. Si tratta di una quantità eccessiva, ma il grasso dovrebbe impedire il terreno dalla traboccanti e l'eccesso aiuterà a prevenire le bolle di essere intrappolati quando la cella coperto coprioggetto viene applicato.
   7. Mantenere la camera preparata nel tessuto culturale incubatore fino al momento dell'uso. Incubazioni prolungate, ~ 1 ora dovrebbe essere evitato come mezzo di imaging evaporerà e il cambiamento nella composizione.
4. Eseguire l'assemblaggio finale da camera e l'imaging cellulare dal vivo.
   1. Spostare la camera preparata e un piatto di coprioggetto transfettate dal termostato alla cappa coltura dei tessuti.
   2. L'assemblaggio finale della camera deve essere eseguito rapidamente per garantire le cellule rimangono immersi nel medio e a 37 ° C in continuo.
   3. Utilizzando pinza sterile, rimuovere con attenzione uno coprioggetto dal piatto transfettate, toccare il bordo del vetrino ad un Kimwipe ad allontanarsi mezzo di crescita.
   4. Posizionare il coprioggetto neurone-side-down verso la camera di preparazione. Toccare un lato del coprioggetto per il grasso prima e fare pressione sui bordi per portare il coprioggetto piatto senza bolle cattura. Medio di imaging in eccesso si riverserà come previsto.
   5. Rimuovere l'eccesso medio di imaging, ma attenzione a non scivolare i coprioggetti fuori posizione.
   6. Spostare la camera di pre-riscaldato riscaldatore piattaforma e fissare la camera in posizione.
   7. Trasferimento della camera sul palco.
   8. Per ridurre photobleaching e photoxicity, regolare la lampada per la quantità minima di intensità necessario trovare cellule transfettate.
   9. Trova una cella di interesse con un obiettivo di petrolio a basso ingrandimento (40X). È bene attenersi a un modello di ricerca previste per garantire la copertura massima coprioggetto ed evitare acquisizioni di immagini ridondanti, ad esempio, in alto a sinistra del coprioggetto, scansione su e giù di lavoro a destra.
   10. Passare a un obiettivo alto olio ingrandimento (60-100x) una volta al campo desiderato è stato individuato.
   11. Usare "acquisizione stream" o funzione analoga del software di imaging per registrare un video della dinamica della proteina fluorescente-etichettati.
   12. Prendete una immagine di fase e altre immagini di accompagnamento (ad esempio, GFP solubile) per una successiva analisi e la presentazione.
   13. Salva tutte le immagini prima di esplorare ulteriormente il coprioggetto e registrare il video successivo.
   14. Tipicamente 3-5 video da un coprioggetto è considerata riuscita. Fototossicità e la salute delle cellule generale dovrebbe essere tenuto a mente come il trasporto viene ridotta nelle cellule danneggiate. La salute delle cellule può essere monitorato attraverso l'osservazione al microscopio di fase. Generalmente le registrazioni vengono eseguite per circa 30 minuti per coprioggetto.

Parte 3: Risultati Rappresentante:

Osservazioni dal vivo imaging cellulare consistono tipicamente di video (anche conosciuto come "stack" di immagini) che mostrano il movimento di organelli fluorescente-tag all'interno del campo di vista (Figura 1A). Che accompagna ogni video sono spesso di supporto delle immagini che illustrano l'orientamento del campo visivo rispetto alle cellule del corpo, il livello di espressione proteica e / o la salute della cellula. Video di trasporto può essere sottoposto ad analisi quantitativa per la trasformazione in kymographs (Figura 1B). Kymographs sono immagini che illustrano il movimento delle particelle per giustapposizione di scansioni linea in cui è rappresentata ogni volta da un punto di colonna nella chimografo. La Figura 2 mostra come due particelle che si muovono in direzione opposta sono rappresentati in un chimografo. Ulteriori analisi di kymographs in grado di fornire informazioni su flusso di particelle, velocità, lunghezza corsa, inversioni e particelle stazionarie.

Figura 1. Rappresentante vivo cellulare Osservazioni Imaging. (A) dei fotogrammi selezionati da un video di mCherry-tagged attivatore tissutale del plasminogeno (TPA) di trasporto. Singole particelle in movimento nella anterograda (frecce verdi) e retrograda (frecce rosse) sono indicate le direzioni. (B) Kymographs illustrando TPA-mCherry movimento nelassone. Le linee orizzontali in kymographs rappresentano oggetti stazionari, mentre le linee diagonali rappresentano gli organelli abbandonando (pendenza positiva) o verso (pendenza negativa) il corpo cellulare. Le frecce lunghe verde e rosso mostrano i percorsi corrispondenti alle particelle (A). I cambiamenti nel trasporto a causa del reagente depolimerizzazione microtubuli, nocodazole, è illustrato con una chimografo. Si noti la riduzione organelli in movimento per l'assenza di linee diagonali.

Discussion

L'imaging cellulare dal vivo è una tecnica difficile, ma potente per l'osservazione diretta del trasporto degli organelli nei neuroni in coltura. Le difficoltà possono sorgere a monte della procedura con la salute dei neuroni poveri a causa di complicazioni cultura. Di conseguenza, la salute delle cellule (per esempi vedi rif. 4) deve essere valutata prima e dopo la trasfezione osservando i coprioggetti mentre nel mezzo di crescita mediante una cultura microscopio dei tessuti leggeri. Il processo di trasferimento dei neuroni contenenti coprioggetto alla camera di imaging può essere stressante per le cellule, quindi è importante prestare attenzione nel caso manipolare i coprioggetti. Può essere comune per dall'aspetto sano cellule non mostrano di trasporto a causa di ritardi nella procedura, o incomplete pre-riscaldamento di attrezzature o equilibrio dei mezzi di comunicazione di imaging. Per l'analisi del trasporto assonale e l'orientamento dendritiche devono essere conosciuti, cioè distinguendo trasporto anterograda e retrograda. E 'quindi fondamentale per essere sicuri che la posizione di un corpo cellulare è determinata e che un segmento continuo neuronale può essere visto che collega la regione di interesse per il corpo cellulare. Spesso il salvataggio di immagini sovrapposte GFP solubili, o informatively nome del file video salvati, è sufficiente per accertare l'orientamento dei processi 'per le analisi, ad esempio, "Cell1CellBodyUpperLeft".

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
MEM-Eagle with Earle salts and L-glutamine	Reagent	Mediatech, Inc.	10-010-CV
Lipofectamine 2000	Reagent	Invitrogen	11668-027	Transfection reagent
10X Hanks with Ca2+ and Mg2+	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	14185-052	Live-imaging medium
1M HEPES	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	15630-130	Live-imaging medium