Live-Imaging von Dense-Core-Vesikel in Primary hippokampalen Neuronen

Summary

Live Cell Imaging ist von besonderem Nutzen bei der Untersuchung der Dynamik von Organellen Menschenhandel. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Live-Darstellung von Dense-Core-Vesikel in kultivierten Neuronen mit Weitwinkel-Fluoreszenzmikroskopie. Dieses Protokoll ist flexibel und kann an image anderen Organellen wie Mitochondrien angepasst werden, Endosomen und Peroxisomen.

Abstract

Beobachtung und Charakterisierung dynamischer zellulärer Prozesse liefern wichtige Informationen über die Zellaktivität, die nicht aus statischen Bildern gewonnen werden kann. Vital fluoreszierenden Sonden, besonders grün fluoreszierende Protein (GFP) revolutioniert haben Zellbiologie, die aus der Fähigkeit, spezifische intrazelluläre Kompartimente und zelluläre Strukturen Etikett. Zum Beispiel haben die Live-Darstellung von GFP (und seine spektralen Varianten) Chimären für eine dynamische Analyse des Zytoskeletts, Organellentransports und Membran Dynamik in einer Vielzahl von Organismen und Zelltypen [1-3] erlaubt. Obwohl Live-Bildgebung hat sich verbreitet, dieser Ansatz wirft immer noch viele technische Herausforderungen, vor allem in primären kultivierten Neuronen. Eine Herausforderung ist die Expression von GFP-markierten Proteine ​​in post-mitotischen Neuronen, die andere ist die Fähigkeit, fluoreszierende Bilder zu erfassen bei gleichzeitiger Minimierung der Phototoxizität, Ausbleichen und Wartung allgemein Zelle Gesundheit. Hier bieten wir ein Protokoll, das eine Lipid-basierte Transfektion Methode, die einen relativ niedrigen Transfektionsrate (~ 0,5%) ergibt beschreibt, ist aber ideal für die Abbildung vollständig polarisierte Neuronen. Eine geringe Transfektionseffizienz ist unerlässlich, so dass einzelne Axone und Dendriten im Hinblick auf ihre Orientierung an den Zellkörper charakterisiert werden kann, um die Ausrichtung des Verkehrs, dh anterograde v. retrograde bestätigen. Unser Ansatz zur Bildgebung GFP-exprimierenden Neuronen beruht auf einem Standard-wide-field Fluoreszenzmikroskop mit einer CCD-Kamera, Bild-Capture-Software, und ein beheiztes Bildgebung Kammer ausgestattet. Wir haben eine Vielzahl von Organellen oder Strukturen abgebildet werden, zum Beispiel, dense-core Vesikel, Mitochondrien, Wachstum Kegel, und Aktin ohne besondere Optik oder Anregung andere Anforderungen als einer fluoreszierenden Lichtquelle. Darüber hinaus können spektral unterschiedlichen, fluoreszenzmarkierten Proteine, zB GFP und DsRed-markierte Proteine ​​werden in der Nähe gleichzeitig visualisiert werden, um Co-Transport-oder andere koordinierte zelluläre Ereignisse zu charakterisieren. Die Bildgebung hier beschriebene Ansatz ist flexibel für eine Vielzahl von Imaging-Anwendungen und kann durch ein Labor für die relativ geringen Kosten angenommen werden, falls ein Mikroskop zur Verfügung.

Protocol

Teil 1: Transfektion von Neuronen mit Lipofectamine 2000 (Invitrogen)

Gerätesatz-up:

Ratte oder Maus Hippocampus-Neuronen sind nach Kaech und Banker, 2006 kultivierte [4]. Die typischen Zelldichte für Transfektionen verwendet beträgt 250.000 cells/6-cm Gericht. Erforderliche Reagenzien und Geräte umfassen 50 mM Kynurensäure, regelmäßige Benchtop Rohrhalter, Tisch-Kühler (am besten Lipofectamine Reagenz kalt zu halten),
Lipofectamine Reagenz, MEM, Mikrozentrifugenröhrchen, micropipetters und einer sterilen Pinzette.

Vorgehensweise:

1. Für jede Transfektion Label zwei 1,5 ml-Röhrchen, einer der Plasmid-DNA, einer der Transfektionsreagenz enthalten enthalten. Die folgenden Inkubationen können bei Raumtemperatur ablaufen.
   1. Kombinieren 1,0 ug von Plasmid-DNA mit 100 ul MEM in einem Röhrchen (ohne Zusätze jeglicher Art; MEM braucht nicht auf eine Temperatur von pH äquilibriert werden).
   2. Kombinieren 6,0 ul Lipofectamine mit 100 ul MEM in den anderen 1,5 ml Tube.
      1. Keine Anpassungen für doppelte Transfektionen benötigt werden, obwohl die Lipofectamine: DNA-Verhältnis in solchen Fällen halbiert werden. Das Verhältnis von Lipofectamine: DNA ist noch innerhalb des Herstellers Vorschlag. Am besten ist es 0,5-1,0 pg für jedes Plasmid-Test für eine optimale Expression.
      2. Zur Wahrung der Haltbarkeit des Lipofectamine Reagenz, sollte es aus dem Kühlschrank für so kurze Zeit wie möglich entfernt werden und in ein Tisch-Kühler, wenn nicht in Gebrauch ist.
         Insgesamt benötigte Zeit aus dem Kühlschrank sollte auf ein Minimum reduziert werden.
2. Die Röhrchen für 5 Minuten bei Raumtemperatur.
3. Übertragen Sie die DNA-in-MEM-Lösung in die Lipid-Röhre, und vorsichtig mit Pipette mischen, dann inkubieren für 30 Minuten bei Raumtemperatur.
4. Nach 25 Minuten vor Flipping Deckgläser mit 60 ul 50 mM Kynurensäure zu excitoxic Schäden an der Schale von kultivierten Neuronen zu minimieren.
   1. Sorgfältig Flip Deckgläser Fuß-side-up mit einer sterilen Pinzette und so zu arrangieren, sie sich nicht überlappen. Achten Sie darauf, das Neuron-beschichteten Oberfläche des Deckglases oder der Glia-beschichtete Oberfläche der Schale kratzen.
5. Nehmen Sie ca. 0,5 ml Medium aus dem 6-cm-Spiegel und vorsichtig mit DNA-Mix in Rohr, den Transfer der DNA-Lösung zurück in die Schüssel tropft gleichmäßig auf die Oberfläche des Mediums.
6. Nicht Wirbel, sondern schieben Sie Teller hin und her in eine Richtung, dann stoppen und wiederholen in senkrechter Richtung zur gleichmäßigen Verteilung der DNA-Lipofectamine Komplexe. Inkubieren für 90 Minuten in der Gewebekultur-Inkubator (37 ° C, 5% CO _2).
7. Flip Deckgläser Fuß-side-down, und vereinbaren, so dass sie sich nicht überschneiden. Lassen Ausdruck für die gewünschte Zeit vor, in der Regel über Nacht auf 48 Stunden.

Teil 2: Live Darstellung von GFP-markierten dichten Kern Vesikel in kultivierten Hippocampus-Neuronen

Gerätesatz-up:

1. Imaging lebender Zellen erfordert ein Fluoreszenzmikroskop mit einer CCD-Kamera ausgestattet, verwenden wir ein Leica DMI 6000B inversen Mikroskop mit der Leica variable, Leuchtstofflampe ausgestattet. Ebenfalls erforderlich ist ein bildgebendes Kammer mit Temperaturregler und eine objektive Heizung. Wir nutzen die Warner Instruments RC-21BR für einen 18-mm Deckglas darüber hinaus eine Plattform Heizung geändert (Kat. # PH2) und Temperaturregler (Kat. # TC324B). Die Kammer enthält keine offenen Ports, eine Modifikation, enthalten bei der Bestellung der Kammer werden kann. Eine objektive Heizung wird dringend empfohlen, zur Aufrechterhaltung der Temperatur des Deckglases und minimieren Veränderungen im Fokus aufgrund von Temperaturschwankungen. Die Bilder werden mit einem Hamamatsu Orca-ER mit Metamorph (Molecular Devices) Software einschließlich der "Streaming"-Modus des Erwerbs drop-in erworben. Note-Wir verwenden keine der Klimakammer, dass das gesamte Mikroskop umschließt. Dieser Zusatz ist teuer und nicht notwendig für die kurzfristige Bildgebung beschrieben.
2. Andere Geräte und Reagenzien sind frisch zubereitet leben Bilderzeugungsmediums (1X Hanks mit Ca ^{2 +} und Mg ^{2 +,} 0,6% Glucose und 10 mM HEPES), zusätzliche 18-mm Deckgläser, sterilen Pinzette, nicht-sterilen Pinzette, Kimwipes, Vakuumfett und einer Spritze (ohne Kanüle oder mit modifizierten breite Injektionsnadel), mit dem Fett gelten.

Vorgehensweise:

1. Bereiten Sie frische Live-Imaging-Medium (1X Hanks mit Ca ^{2 +} und Mg ^{2 +,} 0,6% Glucose und 10 mM HEPES). Wir bereiten in der Regel zu einem Zeitpunkt und zu speichern 50mls bei 4 ^o C, wenn nicht in Gebrauch ist. Am besten ist es, genügend vorbereitet für nicht mehr als eine Woche nach dem anderen. Etwa 5-10 ml pro Schale von Neuronen verwendet.
2. Starten Mikroskop, Kamera, Leuchtstofflampe, und Bildaufnahme-Software. Auch das Gerät einzuschalten, um die Kammer-Plattform und Ziel-Heizungen.
3. Bereiten Sie das vorstelleng Kammer.
   1. Die Warner Kammer enthält ein Teflon-Einsatz für die Montage von Deckgläsern. Für eine einfache Handhabung, Kennzeichnung der einen Seite des Einsatzes "top" mit einem Permanent-Marker.
   2. Tragen Sie einen Ring von Fett in die Nut rund um das Loch in der Seite der Kammer mit der Aufschrift "top". Vermeiden Sie die Verwendung überschüssiger, wie es die Kammer betreten und reduzieren den beobachtbaren Bereich.
   3. Mit einer Pinzette, legen einen sauberen, unbenutzten 18-cm Deckglas auf die "top" Seite der Kammer, sanften Druck auf das Deckglas an den Kanten zu einer Abdichtung innerhalb des vertieften Nut der Kammer zu schaffen.
   4. Schalten Sie die Kammer über und wenden Sie einen ähnlichen Ring von Fett in die Nut auf der gegenüberliegenden (unten) Seite der Kammer.
   5. Legen Sie die vorbereiteten Kammer-Unterseite nach oben, auf dem Deckel eines 50-ml-Röhrchen, die einen idealen Raum Halter ist.
   6. Add 750 ul der bildgebenden Medium in die Kammer. Dies ist eine übermäßige Menge, aber das Fett sollte das Medium verhindern das Überlaufen von und die Überschüsse werden zur Vermeidung von Blasen eingeklemmt, wenn die Zelle bedeckt Deckglas aufgebracht wird.
   7. Pflegen Sie die vorbereitete Kammer in der Gewebekultur-Inkubator bis sie benötigt. Längerer Inkubationen sollten ~ 1 Stunde vermieden werden, da die bildgebenden Medium verdampfen und Änderung der Zusammensetzung werden.
4. Führen Sie die letzte Kammer Montage-und Live Cell Imaging.
   1. Bewegen Sie die vorbereitete Kammer und eine Schüssel mit transfizierten Deckgläser aus dem Inkubator in der Gewebekultur Kapuze.
   2. Die endgültige Kammeranordnung sollte rasch erfolgen, um sicherzustellen, dass die Zellen in Medium und bei 37 ° C kontinuierlich eingetaucht bleiben.
   3. Mit einer sterilen Pinzette vorsichtig entfernen Sie eine Deckglas aus den transfizierten Gericht, berühren den Rand des Deckglases einen Kimwipe sich zu ziehen Wachstumsmedium.
   4. Legen Sie das Deckglas Neuron-side-down auf die vorbereitete Kammer. Tippen Sie auf eine Seite des Deckglases, um das Fett erste und Druck ausüben um die Ränder der Deckgläschen flach ohne Einschluss von Luftblasen zu bringen. Überschüssiges Imaging Medium austreten, wie erwartet.
   5. Wischen Sie überschüssiges bildgebenden Medium, aber darauf achten, nicht die Deckgläser aus der Position schieben.
   6. Bewegen Sie die Kammer auf die vorgewärmten Plattform Heizung und befestigen Sie die Kammer statt.
   7. Übertragen Sie die Kammer auf die Bühne.
   8. Zur Reduzierung der Ausbleichung und photoxicity, passen Sie die Lampe mit dem Mindestbetrag von Intensität notwendig, um transfizierte Zellen zu finden.
   9. Finden Sie eine Zelle von Interesse mit einem niedrigen Vergrößerung Öl-Objektiv (40x). Es ist vorteilhaft, um eine geplante Suchmuster-Stick, um eine maximale Deckglas Abdeckung zu gewährleisten und um redundante Bildaufnahmen, zB oben links Deckglas, Scannen nach oben und unten arbeiten, um das Recht zu vermeiden.
   10. Wechseln Sie zu einem hohen Vergrößerungen Öl-Objektiv (60-100x) einmal einen gewünschten Bereich gefunden wurde.
   11. Verwenden Sie "stream Übernahme" oder eine vergleichbare Funktion Ihres Bildbearbeitungs-Software, ein Video von fluoreszenzmarkierten Protein Dynamik aufzuzeichnen.
   12. Nehmen Sie ein Phasenbild und andere begleitende Bilder (z. B. lösliche GFP) für die spätere Analyse und Präsentation.
   13. Speichern Sie alle Bilder, bevor Sie das Deckglas weiter und die Aufzeichnung der nächsten Video.
   14. Typischerweise 3-5 Videos von einem Deckglas wird als erfolgreich angesehen. Phototoxizität und allgemeine Zelle Gesundheit sollte im Auge behalten werden als Transport in geschädigten Zellen reduziert wird. Zell-Gesundheit kann durch Beobachtung mit Phasenmikroskopie überwacht werden. Typischerweise Aufnahmen sind für ca. 30 Minuten pro Deckglas durchgeführt.

Teil 3: Repräsentative Ergebnisse:

Live Cell Imaging Beobachtungen bestehen typischerweise aus Videos (auch als "Stapel" von Bildern bekannt), die Bewegung der Fluoreszenz-markierten Organellen zeigen im Sichtfeld (Abbildung 1A). Begleitende jedem Video werden häufig unterstützende Bilder, die Ausrichtung des Sichtfeldes zeigen in Bezug auf die Zellkörper, Niveau der Proteinexpression und / oder die Gesundheit der Zelle. Videos von Verkehr zu quantitativen Analyse durch Transformation werden kymographs (Abbildung 1B) unterzogen. Kymographs sind Bilder, die Partikelbewegung zeigen in der Gegenüberstellung Linien-Scans, wo jedem Zeitpunkt durch eine Spalte in der Kymographion vertreten ist. Abbildung 2 zeigt, wie zwei Teilchen, die sich in entgegengesetzter Richtung in einem Kymographion vertreten sind. Eine weitere Analyse der kymographs können Informationen über Teilchenstrom, Geschwindigkeit, Auflagenhöhe, Umkehrungen und stationäre Partikel.

Abbildung 1. Representative Live Cell Imaging Beobachtungen. (A) Ausgewählte Bilder aus einem Video des mCherry-tagged Tissue Plasminogen Activator (TPA) zu transportieren. Einzelne Teilchen bewegen in der anterograde (grüne Pfeile) und retrograde (rote Pfeile) Richtungen angegeben sind. (B) Kymographs illustrieren TPA-mCherry Bewegung in denAxon. Horizontale Linien in kymographs stellen stationäre Objekte, während diagonale Linien Organellen weg von (positive Steigung) oder in Richtung (negative Steigung) der Zellkörper zu vertreten. Die langen, grünen und roten Pfeile zeigen die Läufe entsprechend der Partikel in (A). Änderungen im Verkehr durch die Mikrotubuli depolymerisierenden Reagenz, Nocodazol, ist auch mit einem Kymographion dargestellt. Beachten Sie die Reduzierung der beweglichen Organellen durch das Fehlen von diagonalen Linien.

Discussion

Live Cell Imaging ist eine Herausforderung, aber wirkungsvolle Technik für die direkte Beobachtung von Organellentransports in kultivierten Neuronen. Schwierigkeiten können vor-kommen des Verfahrens mit einer schlechten Neuron Gesundheit, die auf Kultur Komplikationen. Daher sollten Zelle Gesundheit (Beispiele siehe ref. 4) vor und nach der Transfektion durch die Beobachtung der Deckgläser, während in Wachstumsmedium mit einer Gewebekultur Lichtmikroskop beurteilt werden. Der Prozess der Übertragung von Neuron-haltigen Deckgläser auf die Bildgebung Kammer kann stressig sein, um die Zellen, so ist es wichtig, Sorgfalt bei der Bearbeitung der Deckgläser. Es kann gemeinsam für gesund aussehende Zellen kein Transport aufgrund von Verzögerungen bei den Verfahren oder unvollständige Vorwärmen von Geräten oder Äquilibrierung der Bildmedien zu zeigen. Für den Transport Analyse der axonalen und dendritischen Orientierung bekannt sein müssen, dh die Unterscheidung anterograde und retrograde Transport. Es ist daher von entscheidender Bedeutung, um sicherzustellen, dass die Position einer Zelle Körper bestimmt ist und dass eine kontinuierliche neuronalen Segment gesehen verbindet die Region von Interesse für die Zellkörper werden. Oft spart überlappenden Bildern von löslichem GFP oder informativ Namensgebung die gespeicherten Video-Datei, genügt es, die Prozesse "Orientierung für Analysen, z. B." Cell1CellBodyUpperLeft "zu ermitteln.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
MEM-Eagle with Earle salts and L-glutamine	Reagent	Mediatech, Inc.	10-010-CV
Lipofectamine 2000	Reagent	Invitrogen	11668-027	Transfection reagent
10X Hanks with Ca2+ and Mg2+	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	14185-052	Live-imaging medium
1M HEPES	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	15630-130	Live-imaging medium