İlköğretim Kültür Hipokampal Nöronlar Yoğun çekirdekli veziküller Canlı Görüntüleme

Summary

Organel ticareti dinamiklerini inceleyerek canlı hücre görüntüleme özellikle yardımcı programı. Burada geniş alan floresan mikroskobu kullanarak kültürlü nöronların yoğun çekirdekli veziküller canlı görüntüleme için bir protokol. Bu protokol, esnek ve diğer organeller gibi mitokondri gibi görüntü adapte edilebilir, endosomes ve peroksizomlara.

Abstract

Gözlem ve dinamik hücresel süreçleri karakterize, statik görüntüler elde edilemez hücresel aktivite ile ilgili önemli bilgiler verebilmesidir. Vital floresan probları, özellikle yeşil floresan proteininin (GFP), özel hücre içi bölmeleri ve hücresel yapılar etiket yeteneği kaynaklanan hücre biyolojisi alanında devrim yarattı. Örneğin, GFP (ve spektral çeşitleri) kimeralar canlı görüntüleme, organizma ve hücre tipleri [1-3] çok sayıda hücre iskeletinin, organel taşıma ve membran dinamikleri dinamik bir analizi için izin verdiler. Canlı görüntüleme yaygın olmasına rağmen, bu yaklaşım, özellikle de primer kültürlerinde nöronlar hala birçok teknik zorluklar teşkil etmektedir. Karşılaşacağı zorluklardan birinin, post-mitotik nöronlar GFP etiketli proteinlerin bir deyimdir; diğer photobleaching ve genel hücre sağlığı korumak, fototoksisite en aza indirirken, floresan görüntü yakalama yeteneğidir. Burada ise tamamen kutuplaşmış nöron görüntüleme için idealdir, nispeten düşük transfeksiyon oranı (~% 0.5) veren bir lipid tabanlı transfeksiyon yöntemi tanımlayan bir protokol sağlar. Anterograd v. retrograd yönlülük, ulaşım, yani tek bir akson ve dendritler onaylamak için hücre gövdesi yönlendirme olarak karakterize edilebilir böylece düşük transfeksiyon oranı çok önemlidir. Nöronlar ifade görüntüleme GFP Bizim yaklaşımımız, bir CCD kamera, görüntü yakalama yazılımı, ve ısıtılmış bir görüntüleme odası ile donatılmış bir standart geniş alan floresan mikroskop dayanmaktadır. Biz, herhangi bir özel optik veya floresan ışık kaynağı dışında uyarma gereksinimleri olmadan, örneğin, yoğun çekirdekli veziküller, mitokondri, büyüme konileri, aktin organellere veya yapıların geniş bir yelpazede görüntülü var. Ayrıca, spektral-farklı floresan ile işaretlenmiş proteinler, örneğin, GFP ve proteinler dsRed etiketli, ortak taşıma veya diğer koordineli hücresel olayları karakterize etmek için aynı anda yakın görüntülenmiştir olabilir. Burada açıklanan görüntüleme yaklaşım görüntüleme uygulamaları çeşitli için esnek ve nispeten daha az maliyetli bir laboratuvar tarafından kabul edilebilir bir mikroskop kullanılabilir sağladı.

Protocol

Bölüm 1: Lipofectamine 2000 (Invitrogen) kullanarak nöronların Transfeksiyon

Ekipman set-up:

Sıçan veya fare hipokampal nöronlar Kaech ve Banker, 2006 göre kültür [4]. Transfections için kullanılan tipik bir hücre yoğunluğu 250.000 cells/6-cm yemektir. Gerekli reaktifleri ve ekipman 50 mM kynurenic asit, düzenli bir masa üstü tüp tutucu, bir benchtop soğutucu (en iyi Lipofectamine reaktif soğuk tutmak için),
Lipofectamine reaktif, MEM, mikrofuge'de tüpler, micropipetters, ve steril forseps.

Prosedür:

1. Her bir Transfeksiyonu etiket için iki adet 1,5 ml tüpler; transfeksiyon reaktif içeren bir plazmid DNA içeren bir. Aşağıdaki inkubasyon oda sıcaklığında devam edebilirsiniz.
   1. Bir tüp içinde 100 mcL MEM ile 1,0 mikrogram plazmid DNA birleştirin (herhangi bir tür takviyeleri olmadan; MEM dengelenmiş pH sıcaklık olmak zorunda değildir).
   2. 6.0, diğer 1.5 ml tüp 100 mcL MEM mcL Lipofectamine birleştirin.
      1. DNA oranı, bu gibi durumlarda yarı yarıya olacak: çift transfections için ayarlamalar Lipofectamine bile gereklidir. Lipofectamine oranı: DNA üreticinin önerisi içinde devam etmektedir. En iyi ifade etmek için her plazmid için 0.5-1.0 mg test etmek için en iyisidir.
      2. Lipofectamine reaktif raf ömrünü korumak için, mümkün olduğu kadar kısa bir süre için buzdolabında kaldırılmış olmalıdır ve kullanılmadığı zaman bir benchtop soğutucu yerleştirilir.
         Toplam süre buzdolabında en az tutulmalıdır.
2. Tüpler oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
3. DNA-MEM çözüm lipid tüp içine aktarın ve hafifçe sonra oda sıcaklığında 30 dakika inkübe, pipet ile karıştırın.
4. 25 dakika sonra, saygısız lamelleri önce, kültürlü nöronların çanak excitoxic hasarı en aza indirmek için 50 mM kynurenic asit 60 mcL ekleyin.
   1. Ayak tarafı dikkatlice çevirin lamelleri steril forseps kullanarak ve üst üste kalmaz düzenlemek. Lamel nöron kaplı yüzey veya çanak glia kaplı yüzey kazımak için dikkatli olun.
5. Orta yaklaşık 0,5 mL 6 cm çanak alın ve yavaşça tüp DNA ile karıştırın, orta yüzeye eşit damlama çanak geri DNA çözümü transfer.
6. Girdap, ancak tek bir yöne doğru hafifçe ileri geri çanak kaydırın, sonra durdurmak ve DNA Lipofectamine kompleksleri eşit dağıtmak için dik yönde tekrarlayın. Doku kültürü inkübatör (37 ° C,% 5 CO ₂₎ 90 dakika inkübe edin.
7. Birbirlerini kalmaz çevir lamelleri ayak tarafı aşağı ve düzenleyebilirsiniz. Ifadesi 48 saat tipik bir gecede, istenilen zaman için devam etmek için izin verin.

Bölüm 2: kültürlü hipokampal nöronlar GFP etiketli yoğun çekirdekli veziküller Canlı görüntüleme

Ekipman set-up:

1. Görüntüleme canlı hücrelerin bir CCD kamera ile donatılmış bir floresan mikroskop gerektirir; Leica değişken, floresan lamba ile donatılmış bir Leica DMI 6000B inverted mikroskop kullanıyoruz. Ayrıca, sıcaklık kontrolörü ve objektif bir ısıtıcı ile bir görüntüleme odası gereklidir. Warner Instruments RC-21BR (kat. # TC324B) bir platform ısıtıcı ek olarak 18 mm lamel güncellenmiştir (kat. # PH2) ve sıcaklık kontrolörü kullanın. Odasının açık portlar, odasının sipariş eklenebilir bir değişiklik içeriyor. Son derece objektif bir ısıtıcı lamel sıcaklığını korumak ve sıcaklık dalgalanmaları nedeniyle odak değişiklikleri en aza indirmek için tavsiye edilir. Görüntüler Metamorph (Moleküler Cihazlar) yazılımını kullanarak satın alma 'akış' modunda açılan dahil olmak üzere bir Hamamatsu Orca-ER ile elde edilir. Not-Biz tüm mikroskop içine iklim odasında kullanmayın. Bu ek pahalı ve burada açıklanan kısa vadeli görüntüleme için gerekli değildir.
2. Diğer ekipman ve reaktifler taze hazırlanmış canlı görüntüleme orta (1X ile Hanks Ca ^{2 +} ve Mg ^{2 +%} 0.6, Glikoz, ve 10mM Hepes), ek 18 mm cam lamelleri, steril forseps, non-steril forseps, Kimwipes, vakum gres ve gres uygulamak için bir şırınga (iğne olmadan, ya da değiştirilmiş geniş çaplı bir iğne ile).

Prosedür:

1. (1X ile Hanks Ca ^{2 +} ve Mg ^{2 +%} 0.6, Glikoz, ve 10mM Hepes) taze canlı görüntüleme ortamı hazırlayın . Kullanılmadığı zaman genellikle 4 ^° C'de bir zaman ve mağaza 50mls hazırlar. Bir defada en fazla bir hafta için yeterli hazırlamak için en iyisidir. Yaklaşık 5-10 ml nöron çanak başına kullanılır.
2. , Mikroskop, fotoğraf makinesi, floresan lamba, ve görüntü elde etme yazılımı başlatın. Ayrıca oda platformu ve objektif ısıtıcıları açın.
3. Hayal hazırlayıng kamara.
   1. Warner odası lamelleri montaj için bir teflon eklemek içerir. Kolaylığı için kalıcı bir kalem ile insert "top" manipülasyon, etiket bir tarafında.
   2. "Top" etiketli odasının yan tarafındaki deliği çevreleyen oluk yağ halkası uygulayın. Odasına girin ve gözlemlenebilir alanı azaltmak fazla kullanmaktan kaçının.
   3. Forseps kullanarak, "top" yan odanın bir temiz, kullanılmamış 18 cm lamel eklemek odasının gömme oluk içinde sıkı bir mühür oluşturmak için kenarlarından lamel hafif basınç uygulayın.
   4. Odasının ters çevirin ve odasının ters (alt) tarafında oluk yağ benzer bir halka uygulamak.
   5. 50 mL tüp, ideal oda sahibi bir kapak kadar hazırlanan oda alt tarafına yerleştirin.
   6. Odasına görüntüleme orta 750 mcL ekleyin. Bu aşırı miktarda, ancak yağ üzerine dökülüp orta önlemek ve aşırı hücre kaplı lamel uygulandığında sıkışmış olması kabarcıkları önlemeye yardımcı olur.
   7. Kadar gerekli doku kültürü inkübatörde hazırlanan odasına koruyun. Görüntüleme orta buharlaşması ve kompozisyon değişecek gibi uzun süreli inkubasyon ~ 1 saat kaçınılmalıdır.
4. , Nihai kamara montaj ve canlı hücre görüntüleme gerçekleştirin.
   1. Doku kültürü kaputu inkübatör hazırlanan odası ve bir tabak transfekte lamelleri taşıyın.
   2. Son odasına montaj hücreleri, orta ve 37 ° C sürekli dalmış kalmasını sağlamak için hızlı bir şekilde yapılmalıdır.
   3. Steril forseps kullanarak, dikkatle transfekte çanağı bir lamel kaldırmak, besi uzak çizmek Kimwipe lamel kenarına dokunun.
   4. Hazırlanan odasının üzerine lamel nöron tarafı aşağı yerleştirin. Lamel bir tarafında ilk yağ dokunun ve yakalama kabarcıkları olmadan düz lamel getirmek için kenarlarında basınç uygulayın. Aşırı görüntüleme ortamı beklendiği gibi dökülebilir.
   5. Fazla görüntüleme ortamı silin, ancak pozisyon lamelleri slayt dikkatli olun.
   6. Önceden ısıtılmış bir platform ısıtıcı odanın hareket ettirin ve bir yerde oda sıkın.
   7. Odanın sahneye aktarın.
   8. Photobleaching ve photoxicity azaltmak için, lamba, yoğunluk transfekte hücreleri bulmak için gerekli minimum tutar ayarlayın.
   9. Düşük bir büyütme yağ objektif (40X) ile ilgi bir hücre bulun. Maksimal lamel kapsama sağlamak ve sağa çalışma aşağı gereksiz görüntü satın almalar, lamel örneğin, sol üst, tarama ve engellemek için planlı bir arama deseni ayrılmamak için faydalıdır.
   10. İstediğiniz bir alanda bulunan edildikten sonra yüksek bir büyütme yağlı objektif (60-100x) açın.
   11. "Stream satın alma" ya da görüntüleme yazılımı karşılaştırılabilir fonksiyonu floresan etiketli protein dinamiklerinin bir video kaydetmek için kullanın.
   12. Daha sonra analiz ve sunum için bir faz görüntü ve eşlik eden başka herhangi bir görüntü (örneğin Çözünür GFP) ele alalım.
   13. Lamel daha keşfetmek ve sonraki video kayıt önce tüm görüntüleri kaydedin.
   14. Genellikle bir lamel 3-5 videos başarılı kabul edilir. Fototoksisite ve genel hücre sağlığı taşıma hasarlı hücreleri azalır olarak akılda tutulmalıdır. Hücre sağlık faz mikroskopi kullanılarak gözlem ile takip edilebilir. Genelde kayıtları lamel başına yaklaşık 30 dakika süreyle yapılır.

Bölüm 3: Temsilcisi Sonuçlar:

Canlı hücre görüntüleme gözlemler tipik görünümü (Şekil 1A) alanı içinde floresan etiketli organeller hareket video (görüntü "yığınları" olarak da bilinir) oluşur. Her video refakat genellikle protein ekspresyonu ve / veya sağlık hücre hücre gövdesi, seviye ile ilgili görüş alanının yönünü göstermektedir görüntüleri destekliyoruz. Ulaşım Videolar kymographs (Şekil 1B) dönüşümü ile kantitatif analiz tabi tutulabilir. Kymographs her zaman noktası kymograph bir sütun tarafından temsil edilmektedir satırı tarar juxtaposing parçacık hareketi gösteren görüntüler. Şekil 2, ters yönde hareket eden iki parçacığın bir kymograph nasıl temsil göstermektedir. Kymographs daha fazla analiz parçacık akısı, hız, çalışma süresi, ters, ve sabit parçacıklar hakkında bilgi sağlayabilir.

Şekil 1. Temsilcisi Canlı Hücre Görüntüleme Gözlemler mCherry-etiketli Doku plazminojen aktivatörü (TPA) ve ulaşım bir video (A) Seçilmiş kareleri. Bireysel parçacıklar anterograd hareket (yeşil oklar) ve retrograd (kırmızı oklar) yönden gösterilir. (B) gösteren Kymographs TPA-mCherry hareketiakson. Çapraz çizgiler hücre gövdesi (pozitif eğim) veya (negatif eğim) doğru hareket organelleri temsil ederken kymographs Yatay çizgiler, sabit nesneleri temsil eder. Uzun yeşil ve kırmızı oklar (A) parçacıklara karşılık gelen çalışan göstermektedir. Mikrotübül depolymerizing reaktifi nocodazole nedeniyle ulaşım değişiklikler, aynı zamanda bir kymograph ile gösterilmiştir. Çapraz çizgiler yokluğunda hareket organelleri azalma dikkat edin.

Discussion

Canlı hücre görüntüleme kültürlü nöronlarda organel taşıma doğrudan gözlem için zor, ama güçlü bir tekniktir. Güçlükleri kültür komplikasyonlar nedeniyle yoksul nöron sağlığı ile prosedür yukarı çıkabilir. Bu nedenle, hücre sağlığı (örnekler için bkz. Ref. 4) büyüme ortamında doku kültürü ışık mikroskobu kullanılarak lamelleri gözlemleyerek transfeksiyon öncesi ve sonrası değerlendirilmelidir. Aktarılması süreci nöron içeren görüntüleme odasına lamelleri hücrelere stresli olabilir, böylece lamelleri işlenirken özen önemlidir. Sağlıklı görünümlü hücreler prosedürü gecikmeler veya eksik görüntüleme medya ekipman veya dengeleme ön ısıtma nedeniyle hiçbir ulaşım göstermek için ortak olabilir. Taşıma analizi için aksonal ve dendritik yönelim bilinmesi gerekir, anterograd ve retrograd ulaşım ayırt yani. Bu nedenle bir hücre vücudun yerini kararlı ve sürekli bir nöronal segment hücre gövdesi ilgi bölge bağlayan görülebileceği olduğundan emin olmak için kritik öneme sahiptir. Genellikle örtüşen çözünür GFP görüntülerini kaydederek veya bilgilendirici kaydedilen video dosya adlandırma, süreçleri analiz için yönlendirme, örneğin, "Cell1CellBodyUpperLeft" tespit etmek için yeterli.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
MEM-Eagle with Earle salts and L-glutamine	Reagent	Mediatech, Inc.	10-010-CV
Lipofectamine 2000	Reagent	Invitrogen	11668-027	Transfection reagent
10X Hanks with Ca2+ and Mg2+	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	14185-052	Live-imaging medium
1M HEPES	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	15630-130	Live-imaging medium