ERRATUM NOTICE
Important: There has been an erratum issued for this article. Read more …
Summary
التصوير الخلية الحية ذات فائدة خاصة عند دراسة ديناميات الاتجار عضية. نحن هنا وصف بروتوكول لحية كثيفة التصوير الأساسية الحويصلات في الخلايا العصبية مثقف واسع باستخدام الحقل المجهري مضان. هذا البروتوكول هو مرن ، ويمكن أن تتكيف مع العضيات صورة أخرى مثل الميتوكوندريا ، الإندوسومات وperoxisomes.
Abstract
ويمكن رصد وتوصيف العمليات الحيوية الخلوية تعطي معلومات مهمة عن نشاط الخلوية التي لا يمكن اكتسابها من الصور الثابتة. تحقيقات الفلورسنت الحيوية ، وخاصة البروتين الفلوري الأخضر (GFP) أحدثت ثورة في بيولوجيا الخلايا النابعة من القدرة على تسمية محددة المقصورات داخل الخلايا والهياكل الخلوية. على سبيل المثال ، فقد سمح للتصوير حي لالوهم (ومشتقاته الطيفية) GFP لتحليل ديناميكية الهيكل الخلوي والنقل عضية ، والديناميات الغشاء في العديد من الكائنات الحية وأنواع الخلايا [1-3]. على الرغم من أن التصوير العيش أصبحت سائدة ، وهذا النهج لا يزال يشكل تحديات تقنية كثيرة ، ولا سيما في الخلايا العصبية مثقف الابتدائي. التحدي الأول هو التعبير عن GFP الموسومة البروتينات في الخلايا العصبية بعد الإنقسامية ، والآخر هو القدرة على التقاط الصور مع تقليل الفلورسنت الضيائية ، photobleaching ، والمحافظة على الصحة العامة الخلية. هنا نقدم البروتوكول الذي يصف طريقة ترنسفكأيشن الدهون على أساس أن معدل الغلة ترنسفكأيشن منخفضة نسبيا (~ 0.5 ٪) ، ولكن مثالية لتصوير الخلايا العصبية مستقطبة تماما. انخفاض معدل ترنسفكأيشن ضروري بحيث يمكن وصفها احد المحاور والتشعبات ولميولهم الى خلايا الجسم لتأكيد اتجاهها النقل ، أي تقدمي ضد الرجعية. نهجنا في GFP التصوير معربا عن الخلايا العصبية تعتمد على مجال واسع المجهر الفلورسنت القياسية مزودة كاميرا CCD ، برامج التقاط الصور ، وغرفة التصوير ساخنة. وقد التقط لدينا تشكيلة واسعة من العضيات أو هياكل ، على سبيل المثال ، كثيفة الأساسية الحويصلات ، الميتوكوندريا مخاريط النمو ، ودون أي أكتين البصريات خاصة أو متطلبات أخرى الإثارة من مصدر ضوء الفلورسنت. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن طيفيا ، متميزة ، والبروتينات fluorescently المسمى ، على سبيل المثال ، والبروتينات GFP dsRed الموسومة ، يمكن تصور القريب في وقت واحد لتحديد خصائص النقل المشترك أو غيرها من الأحداث الخلوية منسقة. النهج التصوير الموصوفة هنا هي مرنة لمجموعة متنوعة من تطبيقات التصوير ويمكن اعتمادها من قبل مختبر لتوفير التكلفة ستكون قليلة نسبيا المجهر هو متاح.
Protocol
الجزء 1 : ترنسفكأيشن من الخلايا العصبية باستخدام Lipofectamine 2000 (Invitrogen)
معدات انشاء :
تستزرع الفئران أو الماوس الخلايا العصبية قرن آمون وفقا لKaech بانكر ، 2006 [4]. كثافة الخلية المعتادة المستخدمة في transfections 250،000 صحن cells/6-cm. الكواشف والمعدات المطلوبة وتشمل حمض 50 ملي kynurenic ، حامل أنبوب الفوق العادية ، وبرودة الفوق (أفضل للحفاظ على Lipofectamine الباردة الكاشف) ،
Lipofectamine الكاشف ، MEM ، وأنابيب microfuge ، micropipetters ، وملقط معقم.
الإجراء :
- لكل تسمية ترنسفكأيشن two 1.5 مل من الأنابيب ، واحدة تحتوي على الحمض النووي البلازميد ، واحدة تحتوي على كاشف ترنسفكأيشن. يمكن للحضانات التالية المضي قدما في درجة حرارة الغرفة.
- الجمع بين 1.0 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميد مع 100 ميكرولتر MEM في أنبوب واحد (بدون ملاحق من أي نوع ؛ MEM لا تحتاج إلى أن تكون درجة الحرارة من درجة الحموضة معايرتها).
- الجمع بين 6.0 Lipofectamine ميكرولتر مع 100 ميكرولتر MEM في الأنبوب الآخر مل 1.5.
- ليس هناك حاجة لتعديلات transfections مزدوجة على الرغم من أن Lipofectamine : سيتم النصف نسبة الحمض النووي في مثل هذه الحالات. نسبة Lipofectamine : الحمض النووي لا يزال ضمن اقتراح الشركة المصنعة. فمن الأفضل لاختبار 0،5-1،0 ميكروغرام لكل البلازميد عن التعبير الأمثل.
- للحفاظ على العمر الافتراضي للكاشف Lipofectamine ، يجب إزالته من الثلاجة لفترة قصيرة بقدر الإمكان ، ووضعها في برودة الفوق عندما لا تكون قيد الاستعمال.
يجب أن تبقى إجمالي الوقت للخروج من الثلاجة إلى الحد الأدنى.
- احتضان الأنابيب لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- نقل الحمض النووي في حل - MEM في الأنبوب الدهن ، ويخلط بلطف مع ماصة ، ثم احتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- بعد 25 دقيقة ، قبل coverslips التقليب ، وإضافة 60 ميكرولتر من حمض kynurenic 50 ملم إلى تقليل الضرر excitoxic إلى طبق من الخلايا العصبية مثقف.
- coverslips الوجه بعناية قدم من جانب المتابعة باستخدام ملقط معقم ، وترتيبها بحيث لا تتداخل. يجب الحرص على عدم كشط سطح الخلايا العصبية المغلفة للساترة أو السطح الدبق المغلفة للطبق.
- تأخذ ما يقرب من 0.5 مل من المتوسط من الطبق 6 سم ، وبلطف مع مزيج من الحمض النووي في الأنبوب ، ونقل الحل DNA إلى صحن المرق بالتساوي على سطح المتوسط.
- لا الدوامة ، ولكن الشريحة بلطف طبق ذهابا وإيابا في اتجاه واحد ، ثم توقف وكرر في اتجاه عمودي على توزيعها بالتساوي المجمعات الحمض النووي Lipofectamine. احتضان لمدة 90 دقيقة في نسيج الثقافة الحاضنة (37 درجة مئوية ثاني ، و 5 ٪ 2).
- coverslips أقدام الجانب الآخر إلى أسفل ، وترتيبها بحيث لا تتداخل. تتيح التعبير عن المضي قدما في الوقت المطلوب ، بين عشية وضحاها عادة إلى 48 ساعة.
الجزء 2 : تصوير مباشر من الحويصلات كثيفة الأساسية GFP الموسومة الخلايا العصبية في قرن آمون مثقف
معدات انشاء :
- تصوير الخلايا الحية يتطلب مضان المجهر مزودة كاميرا CCD ، ونحن نستخدم المجهر لايكا 6000B DMI مقلوب مجهزة المتغير لايكا ، ومصباح الفلورسنت. المطلوب أيضا هو غرفة التصوير مع تحكم في درجة الحرارة وتدفئة الهدف. نستخدم الآلات وارنر RC - 21BR تعديل لساترة 18 ملم ، بالإضافة إلى منصة سخان (الفئة # PH2) وتحكم في درجة الحرارة (الفئة TC324B #). الغرفة تحتوي على أي منافذ مفتوحة ، وهو التعديل الذي يمكن تضمينها عند الطلب الغرفة. ينصح بشدة على الهدف سخان للمساعدة في الحفاظ على درجة حرارة ساترة والتقليل من التغيرات في التركيز نظرا لتقلبات درجة الحرارة. يتم الحصول على الصور مع هاماماتسو أوركا - ER باستخدام Metamorph (الأجهزة الجزيئية) والبرمجيات بما في ذلك الوضع "الجري" من انخفاض في اقتناء. علما ، ونحن لا نستخدم دائرة المناخ الذي يحيط المجهر بأكمله. هذا بالإضافة إلى غير مكلف وغير ضروري للتصوير على المدى القصير وصفها هنا.
- غيرها من المعدات والكواشف وتشمل الطازجة المعدة المتوسطة التصوير الحي (1X هانكس مع الكالسيوم والمغنيسيوم 2 + 2 + ، غلوكوز 0.6 ٪ ، وHEPES 10MM) ، إضافية coverslips الزجاج 18 ملم ، ملقط معقم ، ملقط غير معقمة ، Kimwipes والشحوم فراغ ، والمحاقن (بدون الإبرة ، أو مع إبرة واسعة تتحمل تعديل) التي تطبق على الشحوم.
الإجراء :
- إعداد الطازجة المتوسطة التصوير الحي (1X هانكس مع الكالسيوم والمغنيسيوم 2 + 2 + ، غلوكوز 0.6 ٪ ، وHEPES 10MM). نحن نستعد عادة 50mls في وقت وتخزينها في 4 درجة مئوية عندما لا تكون قيد الاستعمال. فمن الأفضل أن يعد ما يكفي لأكثر من أسبوع واحد في وقت واحد. وتستخدم حوالي 50-10 مل لكل طبق من الخلايا العصبية.
- بدء المجهر ، وكاميرا ، مصباح الفلورسنت ، وصورة برامج التملك. بدوره على السلطة أيضا إلى منصة القاعة وسخانات الهدف.
- إعداد تصورز الغرفة.
- غرفة ارنر يتضمن ادخال تفلون لاقامة coverslips. لسهولة ، والتلاعب جانب واحد تسمية "قمة" مع ادخال علامة دائمة.
- تطبيق حلقة من الشحوم في الأخدود المحيطة ثقب في جانب من الغرفة المسمى "كبار". تجنب استخدام الفائض لأنها سوف تدخل الغرفة وتقليص المنطقة يمكن ملاحظتها.
- باستخدام الملقط ، إرفاق ، غير مستخدمة نظيفة ساترة 18 سم على الجانب "رأس" من الغرفة ، والضغط لطيف إلى ساترة على حوافها لإنشاء ختم ضيقة داخل أخدود راحة للغرفة.
- بدوره عبر الغرفة وتطبيق حلقة مماثلة من الدهون الى أخدود على الجانب (القاع) المعاكس للغرفة.
- وضع استعداد الغرفة القاع الجانب المتابعة على غطاء أنبوب 50 مل ، وهو صاحب غرفة مثالية.
- إضافة 750 ميكرولتر من المتوسطة إلى غرفة التصوير. هذا هو المبلغ الزائد ، ولكن يجب منع الشحوم متوسطة من امتداد والفائض سوف تساعد على منع هذه الفقاعات من الوقوع في الفخ عندما يتم تطبيق ساترة الخلية المغطاة.
- الحفاظ على غرفة أعدت في الأنسجة حاضنة الثقافة لحين الحاجة إليها. حضانات لفترة طويلة ، ينبغي تجنب ~ 1 ساعة كوسيلة التصوير سوف تتبخر وتغيير في تكوينها.
- نفذ التجمع الغرفة نهائيا والعيش التصوير الخلية.
- نقل استعداد الغرفة وطبق من coverslips transfected من الحاضنة للأنسجة هود الثقافة.
- يجب أن يتم تنفيذ التجميع النهائي الغرفة بسرعة لضمان تبقى مغمورة الخلايا في المتوسط وبلغت 37 درجة مئوية باستمرار.
- باستخدام ملقط معقم ، وإزالة بعناية one ساترة من الطبق transfected ، تلمس حافة ساترة لKimwipe أن يوجه بعيدا المتوسطة النمو.
- ساترة مكان الخلايا العصبية من جانب لأسفل على استعداد الغرفة. لمس جانب واحد من الشحوم ساترة لأول والضغط حول حواف لجلب ساترة شقة بدون فقاعات محاصرة. وسوف تزيد المتوسطة التصوير تسرب كما هو متوقع.
- تمحو الزائدة المتوسطة والتصوير ، ولكن يجب الحرص على عدم انزلاق coverslips من الموقف.
- نقل إلى غرفة المدفأة منصة قبل ساخنة وربط الغرفة في مكانها.
- نقل إلى غرفة المرحلة.
- للحد من photobleaching وphotoxicity ، وضبط المصباح إلى الحد الأدنى من كثافة الخلايا اللازمة للعثور على transfected.
- العثور على خلية في المصالح مع هدف التكبير النفط المنخفضة (40X). ومن المفيد التمسك نمط البحث خططت لضمان أقصى قدر من التغطية وساترة لتجنب اقتناء صورة زائدة ، على سبيل المثال ، أعلى يسار ساترة والمسح الضوئي صعودا ونزولا العمل إلى اليمين.
- التحول إلى هدف التكبير النفط المرتفعة (100X 60) مرة واحدة وقد يقع حقل المطلوب.
- استخدام "حيازة دفق" أو وظيفة مماثلة من برامج التصوير الخاص لتسجيل الفيديو من ديناميات fluorescently البروتين المسمى.
- التقاط صورة المرحلة وأي صور أخرى مصاحبة (GFP القابلة للذوبان على سبيل المثال) لتحليلها في وقت لاحق والعرض.
- حفظ كافة الصور قبل استكشاف المزيد من ساترة وتسجيل الفيديو القادمة.
- عادة ما يعتبر من أحد أشرطة الفيديو 3-5 ساترة ناجحة. يجب أن تبقى الضيائية والصحة العامة في اعتبارها الخلية كما هو انخفاض النقل في الخلايا التالفة. يمكن رصد صحة الخلية عن طريق الملاحظة باستخدام المجهر المرحلة. عادة يتم إجراء تسجيلات لحوالي 30 دقيقة لكل ساترة.
الجزء 3 : النتائج الممثل :
يعيش الملاحظات التصوير الخلية تتألف عادة من أشرطة الفيديو (المعروفة أيضا باسم "مداخن" من الصور) التي تظهر حركة العضيات fluorescently الموسومة داخل مجال الرؤية (الشكل 1A). يرافق كل فيديو غالبا ما تدعم الصور التي توضح اتجاه مجال الرؤية بالنسبة لمستوى الخلية والجسد في التعبير البروتين و / أو صحة الخلية. أشرطة الفيديو يمكن ان تخضع للتحليل الكمي النقل عن طريق التحول إلى kymographs (1B الشكل). Kymographs هي الصور التي توضح حركة الجسيمات من خلال ازدواجية بمسح السطر حيث يتم تمثيل كل نقطة زمنية حسب عمود في kymograph. الشكل 2 يوضح كيف تمثل two الجسيمات تتحرك في الاتجاه المعاكس في kymograph. ويمكن إجراء مزيد من التحليل kymographs تقديم معلومات عن تدفق الجسيمات ، والسرعة ، وطول المدى ، الانتكاسات ، وجزيئات ثابتة.
الشكل 1. الممثل التصوير الخلية الحية ملاحظات : (أ) إطارات مختارة من شريط فيديو لmCherry الموسومة منشط البلاسمينوجين النسيجي (TPA) وسائل النقل. الفرد الجسيمات تتحرك في تقدمي (الأسهم الخضراء) وإلى الوراء (السهام الحمراء) وترد الاتجاهات. (B) Kymographs توضح TPA - mCherry الحركة فيمحور عصبي. خطوط أفقية في kymographs تمثل كائنات ثابتة ، بينما خطوط قطري تمثل العضيات الابتعاد عن (ميل إيجابي) أو نحو (انحدار سلبي) في خلايا الجسم. الأسهم طويلة خضراء وحمراء تظهر يدير المقابلة للجزيئات في (A). ويتضح أيضا تغييرات في النقل بسبب الكاشف أنيبيب depolymerizing ، nocodazole ، مع kymograph. لاحظ انخفاض في العضيات تتحرك بسبب عدم وجود خطوط مائلة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يعيش التصوير الخلية هي تقنية صعبة ، ولكنها قوية لمراقبة وسائل النقل المباشر عضية في الخلايا العصبية مثقف. يمكن أن تنشأ صعوبات من المنبع الإجراء مع صحة الخلايا العصبية الفقراء بسبب مضاعفات الثقافة. ولذلك ، ينبغي تقييم صحة الخلية (انظر المرجع للحصول على أمثلة 4) قبل وبعد ترنسفكأيشن بملاحظة coverslips في حين المتوسطة النمو باستخدام مجهر الضوء ثقافة الأنسجة. عملية نقل الخلايا العصبية التي تحتوي على coverslips إلى غرفة التصوير يمكن أن تكون مرهقة للخلايا ، وبالتالي من المهم توخي الحذر عند التعامل مع هذه coverslips. يمكن أن تكون مشتركة لصحة جيدة الخلايا لتظهر أي النقل بسبب التأخير في الإجراء ، أو غير مكتملة قبل التدفئة المعدات أو موازنة وسائل الإعلام التصوير. لتحليل النقل يجب أن يكون معروفا والتوجه محواري شجيري ، أي تمييز النقل تقدمي ورجعي. ومن ثم فهي حاسمة للتأكد من أن يتم تحديد مكان وجود خلايا الجسم والتي يمكن أن تشاهد شريحة المستمر العصبية التي تربط المنطقة من أهمية بالنسبة للخلايا الجسم. إنقاذ متداخلة في كثير من الأحيان صورا لGFP القابلة للذوبان ، أو تسمية informatively ملف الفيديو المحفوظة ، ويكفي للتأكد من اتجاه العمليات "للتحليلات ، على سبيل المثال ،" Cell1CellBodyUpperLeft ".
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
نشكر هارالد هوتر وديكر هيلانة لقراءتهم متأنية لهذه المخطوطة. ونحن نشكر أيضا ريج سيدو من ايكا مايكروسيستمز لخبرته الفنية. وأيد هذا البحث من قبل العلوم والهندسة مجلس الوطني لكندا ، وجائزة # 327100-06 ، وكلية جامعة سايمون فريزر للعلوم.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| MEM-Eagle with Earle salts and L-glutamine | Reagent | Mediatech, Inc. | 10-010-CV | |
| Lipofectamine 2000 | Reagent | Invitrogen | 11668-027 | Transfection reagent |
| 10X Hanks with Ca2+ and Mg2+ | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 14185-052 | Live-imaging medium |
| 1M HEPES | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15630-130 | Live-imaging medium |
References
- Kulic, I. M., et al. The role of microtubule movement in bidirectional organelle transport. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (29), 10011-10016 (2008).
- Jacobson, C., Schnapp, B., Banker, G. A. A change in the selective translocation of the Kinesin-1 motor domain marks the initial specification of the axon. Neuron. 49 (6), 797-804 (2006).
- Barkus, R. V., et al. Identification of an Axonal Kinesin-3 Motor for Fast Anterograde Vesicle Transport that Facilitates Retrograde Transport of Neuropeptides. Mol Biol Cell. 19 (1), 274-283 (2008).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat Protoc. 1 (5), 2406-2415 (2006).
Tags
علم الأعصاب ، العدد 27 ، لايف التصوير الخلية ، والنقل بين الخلايا ، العضيات غشاء محدد ، بروتين الفلورية الخضراء ، والخلايا العصبية قرن آمون ، ترنسفكأيشن ، المجهري مضانErratum
Formal Correction: Erratum: Live Imaging of Dense-core Vesicles in Primary Cultured Hippocampal Neurons.
Posted by JoVE Editors on 01/20/2010.
Citeable Link.
A correction was made to Live Imaging of Dense-core Vesicles in Primary Cultured Hippocampal Neurons. There was an error in the author's name. The author name was corrected to include a middle initial as follows:
David M. Kwinter, Michael A. Silverman
instead of:
David Kwinter, Michael Silverman.
