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Summary
organelle 밀매의 역학을 공부하면 라이브 셀 이미징 특정 유틸리티입니다. 여기 우리는 넓은 필드 형광 현미경을 사용하여 교양 뉴런의 밀도 코어 vesicles의 라이브 영상을위한 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 유연 및 mitochondria와 같은 이미지를 다른 organelles 적응 수 endosomes, 그리고 peroxisomes.
Abstract
관찰하고 역동적인 세포 과정을 특성화하는 것은 정적인 이미지에서 얻은 수없는 세포 활동에 대한 중요한 정보를 얻을 수 있습니다. 바이탈 형광 프로브, 특히 녹색 형광 단백질 (GFP)은 특정 세포내 구획과 세포 구조를 분류하는 능력에서 형태소 분석 세포 생물학 혁명을했습니다. 예를 들어, GFP (및 그 변종 스펙트럼) chimeras의 라이브 영상이 생물과 세포 유형 [1-3]는 수많은에 cytoskeleton, organelle 전송 및 멤브레인 역학의 동적 분석을 위해 사용할 수있다. 라이브 영상이 널리 사용되고 있지만,이 방법은 여전히 특히 기본 교양 뉴런에서 많은 기술적인 도전, 포즈. 하나의 문제는 사후 mitotic의 뉴런에 GFP - 태그 단백질의 표현이며, 다른 하나는 photobleaching, 일반 세포의 건강을 유지, phototoxicity을 최소화하면서 형광 이미지를 캡처하는 능력입니다. 여기 우리는 그러나 완전히 양극 뉴런의 이미징에 이상적입니다, 상대적으로 낮은 transfection 속도 (~ 0.5 %) 산출 지질 기반 transfection 방법을 설명하는 프로토콜을 제공합니다. 단일 axons과 dendrites가 anterograde 대 역행 교통, 즉의 방향을 확인하는 세포 기관에 자신의 방향으로 특성화 할 수 있도록 낮은 transfection 속도가 필수적이다. 뉴런을 표현하는 영상 GFP에 대한 우리의 접근 방식은 CCD 카메라, 이미지 캡처 소프트웨어 및 온수 영상 챔버와 복 표준 넓은 필드 형광 현미경에 의존합니다. 우리는 특별한 광학이나 형광등 광원 이외의 여기 조건없이 예를 들어, 고밀도 코어 vesicles, mitochondria, 성장 콘, 그리고 굴지 organelles 또는 구조의 다양한 몇 군데 있습니다. 또한 spectrally - 별개의, 찬란 표시된 단백질, 예를 들면, GFP 및 dsRed - 태그 단백질은, 공동 운송 또는 다른 조정 세포 이벤트를 특성화 동시에 가까운 시각하실 수 있습니다. 여기에 설명된 이미징 접근 이미징 어플 리케이션의 다양한 유연하고 상대적으로 작은 비용 실험실 채택 수있는 것은 현미경을 사용할 수있는 제공됩니다.
Protocol
1 부 : Lipofectamine 2000 (Invitrogen)을 사용하여 뉴런의 Transfection
장비 설정 :
쥐 또는 마우스 hippocampal 뉴런은 Kaech와 뱅커, 2006에 따라 양식은 [4]. transfections에 사용되는 전형적인 세포 밀도는 250,000 cells/6-cm 요리입니다. 필요한 시약 및 장비 50 MM kynurenic 산성, 일반 benchtop 튜브 홀더, benchtop 쿨러를 (최고 Lipofectamine 시약의 추위를 유지하는) 포함
Lipofectamine 시약, 멤, microfuge 튜브, micropipetters 및 멸균 포셉.
절차 :
- 각 transfection 레이블을위한 두 1.5 ML 튜브, 플라스미드 DNA의 transfection 시약을 포함 한를 포함 하나. 다음 incubations은 실온에서 진행할 수 있습니다.
- 한 튜브 100 μL 멤와 플라스미드 DNA를 1.0 μg을 결합 (모든 종류의 보충없이, 멤은 equilibrated 산도의 온도가 필요하지 않습니다.)
- 다른 1.5 ML 튜브 100 μL 멤와 6.0 μL Lipofectamine을 결합합니다.
- DNA 비율이 같은 경우에 halved됩니다 이중 transfections에 대한 조정은 Lipofectamine이 경우에도 필요하지 않습니다. Lipofectamine의 비율 : DNA는 제조 업체의 제안 이내에 아직도있다. 최적의 표현을위한 각각의 플라스미드에 대한 0.5-1.0 μg을 테스트하는 것이 좋습니다.
- Lipofectamine 시약의 수명을 유지하려면, 그것은 가능 한한 짧은 시간 동안 냉장고에서 제거되어야하며 사용하지 않을 때는 benchtop 쿨러에 배치.
냉장고에서 꺼내 총 시간은 최소로 보관해야합니다.
- 상온에서 5 분 튜브를 품어.
- 지질 관에 DNA 인 멤 솔루션을 전송하고, 부드럽게 실온에서 30 분 부화 후, 피펫과 함께 섞는다.
- 25분 후 틀지 coverslips 전에 교양 뉴런의 접시에 excitoxic 피해를 최소화하기 위해 50 MM kynurenic 산 60 μL를 추가합니다.
- 조심스럽게 플립 coverslips는 피트 쪽 접속 살균 집게를 사용하여, 그들이 중복되지 않도록 조정. coverslip의 신경 세포 - 표면 코팅 또는 접시의 glia - 코팅 표면을 긁어하지 않도록주의하십시오.
- 6 cm 요리에서 매체의 약 0.5 ML를 타고 부드럽게 튜브의 DNA와 혼합, 매체의 표면에 균일하게 떨어지는 접시에 다시 DNA 솔루션을 전송할 수 있습니다.
- 아니 소용돌이지만, 부드럽게 한 방향으로 앞뒤로 요리를 슬라이드를 나서 중지하고 골고루 DNA - Lipofectamine의 단지를 배포하는 수직 방향으로 반복합니다. 조직 문화 인큐베이터 (37 ° C, 5 % CO 2)에 90 분간 품어.
- 그들이 중복되지 않도록 뒤집기 coverslips는 피트 사이드 다운, 그리고 준비. 표현식이 48 시간 일반적으로 하룻밤, 원하는 시간에 진행하도록 허용합니다.
2 부 : 교양 hippocampal 뉴런에 GFP - 태그 고밀도 코어 vesicles의 라이브 영상
장비 설정 :
- 라이브 세포 영상은 CCD 카메라가 장착된 형광 현미경을 요구, 우리는 Leica 변수, 형광등 장착된 Leica DMI 6000B 거꾸로 현미경을 사용합니다. 또한 온도 컨트롤러와 객관적인 히터와 영상 챔버가 필요합니다. 우리는 워너 인스 트루먼 트의 RC - 21BR이 (cat. # TC324B) 플랫폼 히터 이외에 18 mm coverslip에 대한 수정 (cat. # PH2) 및 온도 컨트롤러 사용합니다. 챔버는 열려있는 포트, 챔버 주문시 포함될 수있는 수정을 포함하지 않습니다. 객관적인 히터는 높은 coverslip의 온도를 유지하고 온도 변동에 의한 초점의 변화를 최소화하는 것이 좋습니다. 이미지 수집의 '스트리밍'모드 드롭 포함한 Metamorph (분자 장치) 소프트웨어를 사용하여 하마 오카 - ER과 함께 찾았습니다. 참고 - 우리는 전체 현미경을 encloses 기후 챔버를 사용하지 마십시오. 이것은 또한 비용과 여기에서 설명한 단기 이미지가 필요하지 않습니다.
- 기타 장비 및 시약은 신선한 라이브 영상 매체 (1X 칼슘 2 행크스 +와 MG 2 +, 0.6 %의 포도당과 10mM HEPES), 추가 18 mm 유리 coverslips, 살균 포셉, 비 멸균 포셉, Kimwipes, 진공 그리스를 포함 , 그리고 그리스를 적용하는있는 주사기 (바늘없이 또는 수정 넓은 구멍 바늘로).
절차 :
- (1X 칼슘 2 행크스 +와 MG 2 +, 0.6 %의 포도당과 10mM HEPES) 신선한 라이브 영상 매체를 준비합니다. 사용하지 않을 때 우리는 일반적으로 4 O C에서 시간과 가게에서 50mls 준비합니다. 한 번에 한 병 이상은 안된다 주일 동안 충분한 준비를하는 것이 좋습니다. 약 50-10 ML은 뉴런의 요리마다 사용됩니다.
- 현미경, 카메라, 형광 램프 및 이미지 수집 소프트웨어를 시작합니다. 또한 챔버 플랫폼과 객관적인 히터에 전원을 켭니다.
- 상상 준비g 챔버.
- 워너 챔버는 coverslips의 장착을위한 테플론 삽입을 포함합니다. 영구 마커로 삽입 "최고"의 조작, 라벨 한쪽의 용이성을 위해.
- "맨"이라는 챔버의 측면에있는 구멍을 둘러싼 홈으로 그리스의 반지를 적용합니다. 그것은 챔버를 입력하고 관찰할 수있는 영역을 줄일 수로 초과 사용을 피하십시오.
- 포셉 사용, 챔버의 "최상위"쪽으로 깨끗하고, 사용하지 않은 18 cm coverslip을 첨부 챔버의 recessed 홈 안에 단단히 밀봉을 만들 수의 가장자리에있는 coverslip에 부드러운 압력을 적용합니다.
- 챔버 뒤집어과 챔버의 반대 (아래쪽) 측면에있는 홈에 기름과 비슷한 반지를 적용합니다.
- 이상적인 챔버 소유자가 50 - ML 튜브의 뚜껑까지 -에 대한 준비 챔버 바닥 사이드를 놓습니다.
- 실로 영상 매체의 750 μL를 추가합니다. 이것은 과도한 금액이지만, 그리스를 통해 밝혀 지던에서 매체를 방지해야하며 초과가 휴대 대상 coverslip이 적용되었을 때 갇혀에서 거품을 방지하는 데 도움이됩니다.
- 필요한까지 조직 문화 인큐베이터에서 준비 챔버를 유지합니다. 영상 매체 증발과 조성의 변화하므로 장기간 incubations는 ~ 1 시간은 피해야한다.
- 최종 챔버 어셈블리 및 라이브 셀 이미징을 수행합니다.
- 조직 문화 후드로 인큐베이터에서 준비 챔버와 transfected coverslips의 요리를 이동합니다.
- 최종 챔버 어셈블리는 세포가 중간에서 ° C 연속적으로 37 포장되어 유지하기 위해 신속하게 수행하여야한다.
- 멸균 집게를 사용하면, 조심스럽게 transfected 접시에서 한 coverslip을 제거, 성장 매체를 떼어 놓으 Kimwipe로 coverslip의 가장자리를 만져.
- 준비 챔버에 신경 쪽 다운 coverslip를 놓습니다. 먼저 그리스에 coverslip의 한쪽을 터치하고 트래핑 거품없이 평면 coverslip을 가져 가장자리 주변에 압력을 적용합니다. 초과 영상 매체는 예상대로 밖으로 유출됩니다.
- 초과 이미징 매체를 닦아지만, 위치에서 벗어나 coverslips을 슬라이드하지 않도록주의합니다.
- 사전 온수 플랫폼 히터로 챔버를 이동과 장소에 챔버를 고정.
- 무대에 챔버를 전송합니다.
- photobleaching 및 photoxicity을 줄이기 위해, transfected 세포를 찾기 위해 필요한 강도의 최소 금액에 램프를 조정합니다.
- 낮은 배율 오일 목적 (40X)와 관심의 세포를 찾아보십시오. 그것은 최대한의 coverslip 보험을 보장하고 오른쪽에있는 작업을 아래로 중복 이미지 인수, coverslip의 예를 들어, 왼쪽 위, 최대 스캔 및 방지 계획의 검색 패턴에 충실하기 위해 유용합니다.
- 원하는 필드가 위치되고 나면 높은 배율 오일 목표 (60 - 100x)로 전환합니다.
- 찬란 - 표시 단백질 역학의 동영상을 기록하려면 "스트림 인수"또는 이미징 소프트웨어의 비교 기능을 사용하십시오.
- 나중에 분석 및 프리젠 테이션을위한 단계 이미지와 다른 이미지를 동반 (예 : 가용성식이 GFP) 가져가라.
- 더욱 coverslip을 탐구하고 다음 비디오를 녹화하기 전에 모든 이미지를 저장합니다.
- 통상 coverslip 3-5 동영상이 성공적으로 간주됩니다. 교통이 손상된 세포의 감소로 Phototoxicity와 일반 세포의 건강은 염두에 보관해야합니다. 세포 건강 위상 현미경을 사용하여 관찰하여 모니터링할 수 있습니다. 일반적으로 녹음이 coverslip 당 약 30 분 동안 수행됩니다.
파트 3 : 대표 결과 :
라이브 셀 이미징 관찰은 일반적으로 뷰 (그림 1A)의 분야 내에서 찬란 - 태그 organelles의 움직임을 보여주 비디오 (또한, 이미지의 "스택"으로 함)로 이루어져 있습니다. 각각의 동영상을 동반하는 것은 종종 단백질 발현 및 / 또는 세포의 건강의 세포 기관, 레벨에 관한 전망 분야의 방향을 보여주는 이미지를 지원하고 있습니다. 교통 동영상 kymographs (그림 1B)로 변환하여 정량 분석을 받게 될 수 있습니다. Kymographs는 각 시점이 kymograph의 열에 의해 표현 라인 스캔 juxtaposing하여 입자의 움직임을 보여주는 이미지입니다. 그림 2는 반대 방향으로 이동이 입자가 kymograph로 표현하는 방법을 보여줍니다. kymographs의 자세한 분석은 입자 유량, 속도, 실행 길이, reversals, 그리고 고정 입자에 대한 정보를 제공할 수 있습니다.
그림 1. 대표 라이브 셀 이미징었습니다. mCherry - 태그 티슈 Plasminogen 활성제 (TPA) 교통의 동영상 (A)을 선택 프레임. anterograde 이사 개별 입자 (녹색 화살표)와에 역행 (빨간색 화살표) 방향이 표시됩니다. (B) 해설 Kymographs은 TPA - mCherry 운동축삭. 대각선 라인은 세포 본체에서 (긍정적인 경사) 또는 (음수 경사) 방향으로 멀어 organelles를 대표하면서 kymographs의 수평 라인, 고정된 개체를 나타냅니다. 긴 녹색과 빨간색 화살표는가 (A)의 입자에 해당하는 실행 보여줍니다. 미세 소관 depolymerizing 시약, nocodazole로 인해 교통의 변화는 또한 kymograph와 그림입니다. 대각선 라인의 부재에 의해 움직이는 organelles의 감소에 유의하십시오.
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Discussion
라이브 셀 이미징은 교양 뉴런의 organelle 운송의 직접 관찰하기 위해 도전하지만, 강력한 기술입니다. 어려움 문화 합병증으로 인해 가난한 사람의 신경 세포 건강과 절차의 상류 발생할 수 있습니다. 따라서, 세포 건강 (예제 심판을 참조하십시오. 4) 성장 매체의 조직 문화 라이트 현미경을 사용하는 동안 coverslips을 준수하여 transfection 이전과 이후 평가해야합니다. 전송의 과정을 신경 세포를 포함하고있는 영상 실로 coverslips하면 세포에 스트레스, 따라서 그것은 coverslips을 조작하면주의를 운동하는 것이 중요합니다. 건강 보이는 세포가 프로 시저에서 지연이나 영상 매체의 장비 또는 평균의 불완전한 미리 가열로 인해 어떤 교통 수단을 표시하지하는 것은 일반적인 수 있습니다. 교통 분석을위한 axonal와 돌기 방향을 알 수 있어야합니다, anterograde과 역행 수송을 구별 즉. 그것은 따라서 세포 기관의 위치 결정 및 연속의 연결 세그먼트는 세포 기관에의 관심 지역을 연결하는 볼 수 있는지 확인하는 것이 중요합니다. 종종 가용성 GFP의 이미지를 중복 저장하거나, informatively 저장된 비디오 파일을 명명, 분석을위한 과정 '오리 엔테이션, 예를 들어, "Cell1CellBodyUpperLeft"을 확인할 수있는 충분한 것입니다.
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Acknowledgments
우리는이 원고들의주의 읽기위한 해럴드 허터과 헬레나 데커 감사드립니다. 우리는 또한 자신의 전문 지식에 대한 Leica Microsystems에서 등록 Sidhu 감사합니다. 이 연구는 국립 과학 및 캐나다 공학 협의회, 수상 # 327100-06, 과학의 사이몬 프레 이저 대학의 학부에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| MEM-Eagle with Earle salts and L-glutamine | Reagent | Mediatech, Inc. | 10-010-CV | |
| Lipofectamine 2000 | Reagent | Invitrogen | 11668-027 | Transfection reagent |
| 10X Hanks with Ca2+ and Mg2+ | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 14185-052 | Live-imaging medium |
| 1M HEPES | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15630-130 | Live-imaging medium |
References
- Kulic, I. M., et al. The role of microtubule movement in bidirectional organelle transport. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (29), 10011-10016 (2008).
- Jacobson, C., Schnapp, B., Banker, G. A. A change in the selective translocation of the Kinesin-1 motor domain marks the initial specification of the axon. Neuron. 49 (6), 797-804 (2006).
- Barkus, R. V., et al. Identification of an Axonal Kinesin-3 Motor for Fast Anterograde Vesicle Transport that Facilitates Retrograde Transport of Neuropeptides. Mol Biol Cell. 19 (1), 274-283 (2008).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat Protoc. 1 (5), 2406-2415 (2006).
Tags
신경 과학 제 27 라이브 셀 이미징 세포 내 운송 멤브레인 - 바운드 organelles 녹색 형광 단백질 hippocampal 뉴런 transfection 형광 현미경Erratum
Formal Correction: Erratum: Live Imaging of Dense-core Vesicles in Primary Cultured Hippocampal Neurons.
Posted by JoVE Editors on 01/20/2010.
Citeable Link.
A correction was made to Live Imaging of Dense-core Vesicles in Primary Cultured Hippocampal Neurons. There was an error in the author's name. The author name was corrected to include a middle initial as follows:
David M. Kwinter, Michael A. Silverman
instead of:
David Kwinter, Michael Silverman.
