Imagens ao vivo de vesículas com núcleo denso na Primária Cultivadas neurônios do hipocampo

Summary

Imagens de células vivas é de utilidade particular quando se estuda a dinâmica do tráfico organela. Aqui nós descrevemos um protocolo para geração de imagens ao vivo de vesículas com núcleo denso em neurônios cultivados com grande campo de microscopia de fluorescência. Este protocolo é flexível e pode ser adaptado para outras organelas imagem, tais como mitocôndrias, endossomos, e peroxissomos.

Abstract

Observação e caracterização dinâmica processos celulares podem fornecer informações importantes sobre a atividade celular que não pode ser adquirida a partir de imagens estáticas. Vital sondas fluorescentes, particularmente proteína fluorescente verde (GFP) revolucionaram a biologia celular decorrentes da capacidade de rótulo específico compartimentos intracelular e estruturas celulares. Por exemplo, a imagem ao vivo da GFP (e suas variantes espectral) quimeras têm permitido uma análise dinâmica do citoesqueleto, transporte organela, ea dinâmica da membrana em uma infinidade de organismos e tipos celulares [1-3]. Apesar de imagens ao vivo tornou-se predominante, essa abordagem ainda apresenta muitos desafios técnicos, particularmente no ensino primário neurônios cultivados. Um desafio é a expressão de proteínas GFP na pós-mitóticas neurônios, o outro é a capacidade de capturar imagens fluorescentes, minimizando fototoxicidade, fotodegradação, e manter a saúde das células em geral. Aqui nós fornecemos um protocolo que descreve um método de transfecção lipídica baseado em que produz uma taxa de transfecção relativamente baixo (~ 0,5%), porém, é ideal para a imagem de neurônios totalmente polarizada. A taxa de transfecção baixo é essencial para que os axônios e dendritos só pode ser caracterizada como a sua orientação para o corpo celular para confirmar a direcionalidade de transporte, ou seja, v. anterógrada retrógrada. A nossa abordagem à imagem GFP expressar neurônios depende de um microscópio de campo amplo fluorescente padrão equipado com uma câmera CCD, software de captura de imagem, e uma câmara de imagem aquecida. Temos imaged uma grande variedade de organelas ou estruturas, por exemplo, com núcleo denso vesículas, mitocôndrias cones, crescimento e actina, sem qualquer ótica ou requisitos especiais de excitação que não seja uma fonte de luz fluorescente. Além disso, espectralmente distintas, as proteínas etiquetadas fluorescente, por exemplo, GFP e dsRed marcadas proteínas, podem ser visualizados simultaneamente perto de caracterizar co-transporte ou outros eventos coordenados celular. A abordagem de imagem aqui descrito é flexível para uma variedade de aplicações de imagem e pode ser adotado por um laboratório de custo relativamente pouco desde um microscópio está disponível.

Protocol

Parte 1: Transfecção de neurônios utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen)

Equipamentos de set-up:

Rato ou camundongo neurônios do hipocampo são cultivadas de acordo com Kaech e Banker, 2006 [4]. A densidade celular mais utilizados para a transfections é de 250.000 prato cells/6-cm. Reagentes e equipamentos necessários incluem 50 mM de ácido cinurênico, suporte para tubos regulares de bancada, um refrigerador de bancada (o melhor para manter frio reagente Lipofectamine),
Reagente Lipofectamine, MEM, tubos de micropipetters e pinças esterilizadas.

Procedimento:

1. Para cada rótulo de transfecção dois tubos de 1,5 mL; um para conter o DNA plasmídeo, um para conter o reagente de transfecção. As incubações a seguir podem proceder à temperatura ambiente.
   1. Combine 1,0 mg de DNA plasmidial com 100 MEM mL em um tubo (sem suplementos de qualquer tipo; MEM não precisa ser temperatura de pH equilibrado).
   2. Combine 6,0 Lipofectamine mL com 100 mL de MEM no tubo mL outros 1.5.
      1. Nenhum ajuste para transfections duplo são necessários embora o Lipofectamine: relação DNA serão reduzidos para metade em tais casos. A proporção de Lipofectamine: DNA ainda está dentro sugestão do fabricante. É melhor testar 0,5-1,0 mg para cada plasmídeo de expressão ideal.
      2. Para preservar a vida de prateleira do reagente Lipofectamine, ele deve ser removido da geladeira por um tempo tão curto quanto possível e colocados em um resfriador de bancada, quando não em uso.
         Tempo total fora da geladeira deve ser mantida a um mínimo.
2. Incubar os tubos durante 5 minutos em temperatura ambiente.
3. Transferir a solução de DNA em MEM-no tubo de lipídios, e misture delicadamente com uma pipeta, em seguida, incubar por 30 minutos em temperatura ambiente.
4. Após 25 minutos, antes de lamínulas lançando, adicionar 60 mL de 50 mM de ácido cinurênico para minimizar os danos excitoxic para o prato de neurônios cultivados.
   1. Lamínulas cuidadosamente virar pé-side-up usando uma pinça estéril, e arranjar para que eles não se sobrepõem. Tenha cuidado para não raspar a superfície do neurônio revestido da lamela ou a superfície glia revestido do prato.
5. Demorar cerca de 0,5 mL de meio do prato 6-cm e misture delicadamente com DNA no tubo, transferir a solução DNA de volta para o prato pingando uniformemente sobre a superfície do meio.
6. Não mexa, mas deslize prato e para trás em uma direção, então pare e repita na direção perpendicular para distribuir uniformemente os complexos DNA Lipofectamine. Incubar por 90 minutos na incubadora de cultura de tecidos (37 CO ° C, 5% _2).
7. Lamínulas virar pé-side-down, e arranjar para que eles não se sobrepõem. Permitir a expressão de prosseguir para o tempo desejado, geralmente durante a noite para 48 horas.

Parte 2: imagens ao vivo de GFP-tagged vesículas com núcleo denso em cultura de neurônios do hipocampo

Equipamentos de set-up:

1. Imagens de células vivas requer um microscópio de fluorescência equipado com uma câmera CCD, nós usamos um microscópio Leica DMI 6000B invertido equipado com a variável Leica, lâmpada fluorescente. Também é necessário uma câmara de imagem com controlador de temperatura e um aquecedor objetivo. Usamos a Warner Instruments RC-21BR modificado para uma lamínula de 18 mm, além de um aquecedor plataforma (cat. # PH2) e controlador de temperatura (cat. # TC324B). A câmara contém nenhuma porta aberta, uma modificação que pode ser incluído na encomenda da câmara. Um aquecedor objetivo é altamente recomendado para ajudar a manter a temperatura da lamela e minimizar as alterações no foco devido a flutuações de temperatura. Imagens são adquiridas com um Hamamatsu Orca-ER usando Metamorph software (dispositivos Molecular), incluindo o modo de 'streaming' de aquisição drop-in. Nota-Nós não usamos uma câmara climática que inclui o microscópio inteiro. Esta adição é caro e não é necessário para a imagem de curto prazo descrito aqui.
2. Outros equipamentos e reagentes incluem recém-preparada meio de imagem ao vivo (1X Hanks com Ca ^{2 +} e Mg ^{2 +} Glicose, 0,6%, e HEPES 10mM), adicionais lamínulas de vidro de 18 mm, pinças estéreis, não estéreis fórceps, Kimwipes, graxa de vácuo , e uma seringa (sem agulha ou com agulha modificada grande furo) com o qual se aplique graxa.

Procedimento:

1. Prepare meio de imagem fresca ao vivo (1X Hanks com Ca ^{2 +} e Mg ^{2 +} Glicose, 0,6%, e HEPES 10mM). Normalmente, prepare 50mls de cada vez e armazenar a 4 ^o C, quando não em uso. É melhor preparar o suficiente para não mais de uma semana de cada vez. ML aproximadamente 5-10 são usadas por prato de neurônios.
2. Iniciar microscópio, câmara, lâmpada fluorescente, e software de aquisição de imagem. Também ligar a energia para a plataforma de câmara e aquecedores objetivo.
3. Prepare a imaginarg câmara.
   1. A câmara inclui uma inserção Warner Teflon para a montagem de lamelas. Para maior facilidade de manipulação, com a etiqueta uma das inserir "top" com um marcador permanente.
   2. Aplicar um anel de graxa ao sulco ao redor do buraco no lado da câmara de chamada "top". Evitar o uso de excesso de como ele vai entrar na câmara e reduzir a área observável.
   3. Utilizando uma pinça, coloque um pano limpo, lamela de 18 centímetros não utilizados para o lado "top" da câmara, aplique uma leve pressão para a lamela em suas bordas para criar um selo apertado dentro do sulco recesso da câmara.
   4. Ligue a câmara e aplicar mais de um anel de graxa semelhante ao sulco no lado (inferior) em frente da câmara.
   5. Coloque o lado da câmara bottom-up-preparada na tampa de um tubo de 50 mL, que é um suporte de câmara ideal.
   6. Adicionar 750 mL de meio de imagens para a câmara. Esta é uma quantidade excessiva, mas a graxa deve evitar que o meio de derramar sobre o excesso e vai ajudar a prevenir bolhas de ser preso quando a lamela de células-coberto é aplicada.
   7. Manter a câmara preparada na cultura de tecidos incubadora até que seja necessário. Incubações prolongadas, ~ 1 hora deve ser evitada, o meio de imagem irá evaporar e alteração da composição.
4. Executar a montagem final e câmara de imagens de células vivas.
   1. Mover a câmara preparada e um prato de lamínulas transfectadas da incubadora para a capa de cultura de tecidos.
   2. O conjunto de câmara final deve ser realizada rapidamente para garantir que as células permanecem imersos em médio e em 37 ° C continuamente.
   3. Utilizando uma pinça estéril, remova cuidadosamente uma lamela do prato transfectadas, tocar na borda da lamínula para um Kimwipe para atraírem meio de crescimento.
   4. Coloque a lamela neurônio-side-down para a câmara preparada. Toque um lado da lamela para a graxa primeiro e aplicar pressão ao redor das bordas para trazer a lamela plana, sem bolhas de interceptação. Meio de imagem em excesso derramará fora como esperado.
   5. Limpe o excesso médio de imagem, mas tenha cuidado para não raspar as lamelas fora de posição.
   6. Mover a câmara para o aquecedor plataforma pré-aquecido e fixar a câmara no lugar.
   7. Transferência da câmara para o palco.
   8. Para reduzir fotobranqueamento e photoxicity, ajustar a lâmpada para o valor mínimo de intensidade necessário encontrar células transfectadas.
   9. Encontrar uma célula de interesse com um objetivo pequeno aumento de óleo (40X). É benéfico para furar a um padrão de pesquisa planejada para garantir a cobertura máxima e lamínula para evitar aquisições de imagens redundantes, à esquerda, por exemplo, topo de lamela, digitalização cima e para baixo trabalhando para a direita.
   10. Mudar para um objetivo de ampliação elevada de óleo (60-100x), uma vez por campo desejado foi localizado.
   11. Use "aquisição stream" ou função comparável de seu software de imagens para gravar um vídeo da dinâmica da proteína fluorescente-rotulados.
   12. Dê uma imagem de fase e quaisquer outras imagens que acompanham (GFP Solúvel, por exemplo) para posterior análise e apresentação.
   13. Salvar todas as imagens antes de explorar a lamela mais e gravar o vídeo a seguir.
   14. Tipicamente 3-5 vídeos a partir de uma lamela é considerada bem sucedida. Fototoxicidade e saúde das células em geral deve ser mantido em mente que o transporte é reduzida em células danificadas. Saúde das células pode ser monitorada pela observação através de microscopia de fase. Tipicamente gravações são realizadas por cerca de 30 minutos por lamínula.

Parte 3: Resultados Representante:

Observações imagens ao vivo de células tipicamente consistem de vídeos (também conhecido como "pilhas" de imagens) que mostram o movimento de organelas fluorescente marcadas dentro do campo de visão (Figura 1A). Que acompanham cada vídeo são muitas vezes apoiando as imagens que ilustram a orientação do campo de visão com relação ao nível de célula do corpo, de expressão de proteína e / ou a saúde da célula. Vídeos de transporte pode ser submetido a análise quantitativa por transformação para kymographs (Figura 1B). Kymographs são imagens que ilustram o movimento de partículas pela justaposição de scans linha onde cada momento é representado por uma coluna na quimógrafo. A Figura 2 demonstra como duas partículas que se movem em direção oposta são representados em um quimógrafo. Análise mais aprofundada das kymographs pode fornecer informações sobre fluxo de partículas, velocidade, tempo de execução, reversões, e partículas estacionárias.

Figura 1. Representante Observações Live Cell Imaging. (A) quadros selecionados de um vídeo de mCherry marcadas Plasminogênio Tecidual (TPA) de transporte. Partículas individuais se movendo na anterógrada (setas verdes) e retrógrado (setas vermelhas) direções são indicados. (B) Kymographs ilustrando movimento TPA-mCherry naaxônio. Linhas horizontais em kymographs representam objetos estacionários, enquanto as linhas diagonais representam organelas se afastando (inclinação positiva) ou para (inclinação negativa) o corpo da célula. As setas longo verde e vermelho mostram as corridas correspondentes às partículas em (A). Mudanças no transporte devido ao reagente de microtúbulos depolymerizing, Nocodazol, também é ilustrado com uma quimógrafo. Salientarmos a redução na organelas movendo pela ausência de linhas diagonais.

Discussion

Imagens de células vivas é uma técnica difícil, mas poderosa para a observação direta de organela transporte em neurônios cultivados. Podem surgir dificuldades com a montante do procedimento com pobre saúde neurônio devido a complicações cultura. Portanto, a saúde da célula (para exemplos, ver ref. 4) devem ser avaliadas antes e após a transfecção, observando as lamelas, enquanto em meio de crescimento usando um tecido microscópio de luz cultura. O processo de transferência dos neurônios contendo lamínulas para a câmara de imagem pode ser estressante para as células, assim, é importante ter cuidado ao manipular as lamelas. Ela pode ser comum para com aparência saudável células para mostrar nenhum transporte devido a atrasos no processo, ou pré-aquecimento incompleta de equipamento ou de equilíbrio dos meios de comunicação de imagem. Para análise de transporte a orientação axonal e dendrítico deve ser conhecida, ou seja, distinguir o transporte anterógrado e retrógrado. Portanto, é fundamental para ter certeza de que a localização de um corpo da célula é determinada e que um segmento contínuo neuronal pode ser visto que ligam a região de interesse para o corpo celular. Muitas vezes, salvar imagens sobrepostas de GFP solúveis, ou informativa nomear o arquivo de vídeo salvo, é suficiente para determinar a orientação dos processos "de análises, por exemplo," Cell1CellBodyUpperLeft ".

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
MEM-Eagle with Earle salts and L-glutamine	Reagent	Mediatech, Inc.	10-010-CV
Lipofectamine 2000	Reagent	Invitrogen	11668-027	Transfection reagent
10X Hanks with Ca2+ and Mg2+	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	14185-052	Live-imaging medium
1M HEPES	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	15630-130	Live-imaging medium