剖析酿酒酵母 ASCI

Summary

酵母细胞减数分裂的遗传分析，或选择二倍体受精卵显微操作是需要。这些micromanipulations都是开展使用了解剖镜下微针。微针是用于搬迁细胞的，由显微不同程度的自动化控制。

Abstract

酵母是一种非常听话的模型系统，用于研究许多不同的细胞过程。常见的实验室应变

Protocol

建设二倍体菌株
通过交配生产二倍体议定书“

1. 最初的菌株，应取得YPD，或选择性培养基上，如果必要，产生单菌落。两个单倍体菌株应相反交配型（即MATA和MATα）。
2. 使用无菌接种环挑一个殖民地的一小部分，从两个单倍体菌株之一。在一个新的YPD板连胜循环一次，在整个板块的直线。标记板底部的箭头方向连胜。
3. 重复上相同的YPD板第二应变。这一次连胜垂直殖民地的第一，过路的第一与第二连胜。马克第二连胜的方向，并注意该地区的第二连胜跨越第一。这个区域将是会产生二倍体。
4. 在30℃过夜孵育YPD板。
5. 副本板到选择性培养基YPD板，将有选择地允许新成立的二倍体增长。
6. 选择相同的选择性培养基上单个菌落，如果可能的话，或一个二倍体连胜和连败的一小部分，产生单菌落。

产孢和消化的ASCI
协议

1. 从上述板块中挑选单菌落，使小（1厘米x 1厘米），孢子（SPO）板的补丁，并在30 ° C孵育3-7天，以孢子。
2. 产孢可以在从每一个补丁细胞，光镜下检查。位置细胞，在显微镜幻灯片5-10μL水液滴上放置盖玻片，查找存在的ASCI。如果ASCI不容易被发现，然后放回孵化器。
3. 如果有一个补丁的有效产孢，准备与四分汁100μL无菌15ML锥形管。
4. 挑选从这个产孢修补细胞无菌的3mm接种环（细胞应包括循环的四分之一）和四分体汁。轻轻摇动循环，使细胞脱落与溶液的循环和​​混合。
5. 留在四分汁（含zymolyase），4 - 10分钟（取决于zymolyase和应变本身的浓度和活性）。允许子囊孢子壁细胞消化。
6. 标记在YPD板上接种区域的顶部和底部。
7. 可选。加入1ML冰冷的无菌DH _{2 O}反应，可以停止允许细胞为5分钟解决。从上清液取出1毫升，然后用手轻轻混合置于冰上。
8. 从第5步消化细胞5μL​​，轻轻地滴在接种前显着的YPD板区域。
9. 使用无菌的3mm接种环轻轻地分布在一条线下降1-3倍，而勉强用琼脂接触。
10. 让液体吸收到琼脂（如果省略第7步，这是当外层的细胞壁的消化将减少或停止）。继续解剖镜下。

剖析ASCI
协议

请注意，下面的协议是一个歌手的MSM系统200显微显微镜。该协议可以遵循与轻微的修改，如果使用手动显微操纵器，如蔡司显微致辞。

1. 专注于一个地区的板块，在该领域的一半包含细胞，一半是空的。针慢慢地将成为关注的焦点，倒是该领域的空白区域。这将确保针头不包含从以前使用的细胞。针和琼脂之间的联系被看作是一个暗黑色圆圈，慢慢地成为关注的焦点。
2. 转到位置A1矩阵，并再次刺入琼脂商标。这是为了帮助确定方向的板块，如果它是在完成之前，在显微镜。
3. 切换搜索模式。找到一个ASCI。最好选择在细胞伸长地区的ASCI。避免细胞簇的地区。四个子囊孢子从一个ASCI仍然应该重视对方。两个子囊孢子可能会比其他两个稍微大一点。避免采摘ASCI一个子囊孢子是松散的，而不是连接到其余的子囊。
4. 拿起针子囊。慢慢地将针板。当看到微针的影子，此行与ASCUS最多被拾起。同样的方法针，直到看到一个圆圈（针尖）的黑色轮廓。触摸这个圈子里的四分体，然后迅速拉针。确保所有四个子囊孢子从子囊坚持针和微针，是不是这ASCUS的一部分，不需要额外的细胞聚集。
5. 远离板的微针拉矩阵（第一子囊，去位置A1）。请注意每一个子囊搬迁的位置。将子囊接触与微针板和拉远，直到所有四个子囊孢子脱落的微针。温和攻针手臂或控股YPD板的平台往往是有用的，在这一步。
6. 重复步骤3-5，在矩阵上的连续位置ASCI下来，直到所需数量的ASCI已经回升。
7. 返回到每个子囊和戏弄针，攻丝轻轻平台或两者的结合，打破四个单元。拿起细胞留在矩阵中的一个新的位置，后面四排分开，直到每个子囊孢子在每个子囊。
8. YPD板孵化器放置在30℃，几天来观察经济增长方式。
9. 副本板解剖细胞选择性培养基如有必要。

搬迁的受精卵
协议

1. 数出两个在适当的介质，以获得单菌落相反交配型的单倍体菌株。
2. 伴侣这两个菌株如上所述，并允许将从4〜6小时（或过夜，如果必要的话）。
3. 光显微镜下检查受精卵。受精卵会出现一芽带或不带哑铃状细胞。
4. 匹克细胞3mm的接种环（细胞应包括循环的四分之一），轻轻放置在无菌_{DH 2} O 100μL
5. 标记在YPD板上接种区域的顶部和底部。
6. 取5μL，轻轻地滴在接种前显着的YPD板区域。
7. 使用3mm的接种环，非常轻柔而勉强用琼脂接触传播滴线。
8. 让液体吸收到琼脂。继续解剖镜下。
9. 专注于一个地区的板块，在该领域的一半包含细胞，一半是空的。针慢慢地将成为关注的焦点，倒是该领域的空白区域。这将确保针头不包含从以前使用的细胞。针和琼脂之间的联系被看作是一个暗黑色圆圈，慢慢地成为关注的焦点。
10. 转到位置A1矩阵，并再次刺入琼脂商标。这是为了帮助确定方向的板块，如果它是在完成之前，在显微镜。
11. 切换搜索模式。找到一个受精卵。
12. 拿起针受精卵。
13. 地方受精卵单独的矩阵。
14. 允许受精卵成长为几天。
15. 副本板的受精卵到适当的选择性培养基。

代表性的成果

图1：两个相反的交配型的单倍体菌株交配产生的二倍体菌株。

图2：（A）之间的温度敏感株（用LEU2营养缺陷型）和野生型菌株（LEU2）交配THRE结果YPD板。消化细胞分布在接种地区上的两条黑线之间的厚厚的增长被认为是左。 ASCI被解剖的增长均匀分布在右边的矩阵。 （二）板（一）复制到SD -亮氨酸的辍学板。注意2:2增长LEU2表示经过验证的子囊孢子解剖的标记。 （三）板（一）被复制到YPD板，并在37 ° C孵育注意2:2的增长，进一步验证了一个子囊孢子解剖。

Discussion

酵母夹层是一个有用的工具，选择所需的标记新菌株。当确定四个子囊孢子的理论增长模式，重要的是看的营养细胞的基因型。如果一个质粒是存在的，人们必须知道，如果它是单一的，高或低复制，因为这会影响子囊孢子（S）接收的质粒，并会影响预测和结论，就被操纵的菌株。

某些菌株可以比别人在很短的时间内生产的许多子囊孢子的更好。其他菌株可能产生的子囊孢子的比例很低。这不就可以选择只要足够真实ASCI的实验有任何影响。此外，菌种不同的反应在细胞壁的消化，这是需要凭经验调整孵化时间在四分汁。

选择所需的标记的细胞，当人们应该只选择那些从一个ASCI所有子囊孢子的增长模式对应于理论的经济增长模式，从解剖所有子囊绝大多数导致预期的增长模式。

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Singer MSM System 200	Microscope	Singer Instruments	NA
D-sorbitol	Reagent	BioShop Canada	SOR508
Tris	Reagent	BioShop Canada	TRS001
Zymolyase 100T	Reagent	Seikagaku Corporation	120493
Yeast extract	Reagent	BioShop Canada	YEX401
Peptone	Reagent	BioShop Canada	PEP 403
D-glucose	Reagent	BioShop Canada	GLU501
Yeast nitrogen base	Reagent	BioShop Canada	YNB406
Bio-tryptone	Reagent	BioShop Canada	TRP402
Sodium chloride	Reagent	BioShop Canada	SOD002
Potassium acetate	Reagent	BioShop Canada	POA 301
Agar	Reagent	BioShop Canada	AGR003
Adenine sulfate	Reagent	BioShop Canada	ADS201
L-uracil	Reagent	BioShop Canada	URA 241
L-tryptophan	Reagent	BioShop Canada	TRP 100
L-histidine	Reagent	BioShop Canada	HIS 200
L-arginine	Reagent	Amresco	0877-100G
L-methionine	Reagent	BioShop Canada	MET 222
L-tyrosine	Reagent	BioShop Canada	TYR 333
L-isoleucine	Reagent	BioShop Canada	ISO 910
L-valine	Reagent	BioShop Canada	VAL 201
L-lysine	Reagent	BioShop Canada	LYS 101
L-phenylalanine	Reagent	BioShop Canada	PHA 302
L-glutamic acid	Reagent	BioShop Canada	GLU 202
L-threonine	Reagent	BioShop Canada	THR002
L-leucine	Reagent	BioShop Canada	LEU 222