의 해부 Saccharomyces Cerevisiae Asci

Summary

효모 세포의 미세 조작은 diploid의 zygotes을 선택 meiotic 유전 분석 또는 필요합니다. 이러한 micromanipulations은 해부 현미경의 microneedle를 사용하여 수행됩니다. microneedle는 세포를 재배치하는 데 사용됩니다 및 자동화의 다양한 학위와 함께 사용할 수 있습니다 micromanipulator에 의해 제어됩니다.

Abstract

효모는 다양한 세포 과정을 연구하는 데 사용되는 매우 다루기 쉬운 모델 시스템입니다. 일반적인 실험실 변형

Protocol

diploid의 변종 구축
교배에 의해 diploids 생산을위한 프로토콜

1. 필요, 하나의 식민지를 생성하는 경우 초기 종자는 YPD, 또는 선택적 매체에 밖으로 명중한다. 두 h​​aploid 계통 반대 짝짓기 유형 (예 마타와 MATα)의해야합니다.
2. 멸균 접종 루프를 사용하면 두 개의 haploid 변종 중 하나에서 식민지의 일부를 선택하십시오. 새로운 YPD 판 연속 루프 한번 접시에 걸쳐 직선에서. 접시의 바닥에 화살표와 함께 행진의 방향을 표시합니다.
3. 같은 YPD 접시에 두 번째로 부담이 단계를 반복합니다. 처음으로이 시간은 탄력 콜로니 직각을 두 번째로 첫 번째 승리를 건너. 두 번째 줄무늬의 방향을 선택하고 두 번째 승리가 먼저 교차 영역을 확인합니다. diploids이 생성됩니다 어디에이 지역은 것입니다.
4. 30 ° C 하룻밤에 YPD 번호판을 품어.
5. 복제 판 선택 새로 형성된 diploids의 성장을 허용합니다 선택적 미디어에 YPD 판.
6. 하나의 식민지를 생성하기 위해 같은 선택적 매체에 하나의 식민지 가능한 경우, 또는 diploid 스트 리크와 행진의 일부를 선택하십시오.

Sporulation 및 asci의 소화
프로토콜

1. 위의 접시에서 하나의 식민지를 선택하고 (1cm X 1cm) sporulation (SPO) 접시에 패치를 작게 만들고 sporulate에 3~7일 30 ° C에서 알을 품다.
2. Sporulation은 가벼운 현미경으로 각 패치의 세포를보고하여 확인하실 수 있습니다. 물을 5-10 μl의 현미경 슬라이드에 삽입 세포는 비말 위에 coverslip을 배치하고, asci의 존재를 찾으십시오. asci 쉽게 발견되지 않은 경우 다음 인큐베이터에 다시 넣어.
3. 패치 중 하나에 효과 sporulation가있다면, tetrad 주스의 100μL와 살균 15mL 원뿔 튜브를 준비합니다.
4. 멸균 3mm 접종 루프 (세포가 루프의 ¼을 커버한다) 및 tetrad 주스에서 개최이 sporulation 패치의 세포를 선택하십시오. 부드럽게 소용돌이 세포 솔루션과 루프와 혼합을 떨어져 수 있도록 루프를.
5. 4 - 상업 중심지 (zymolyase 및 변형 자체의 농도와 활동에 따라)에 대한 tetrad 주스 (zymolyase을 포함)에 둡니다. 이것은 ascospores를 둘러싼 세포 벽 소화를 위해 수 있습니다.
6. YPD 접시에 inoculum 지역의 상단과 하단을 표시합니다.
7. 선택 사항입니다. 반응은 차가운 얼음 살균 DH ₂ O.의 1mL를 추가하여 막을 수 세포 5mins에 대한 해결하실 수 있습니다. 뜨는에서 제거 1mL 다음 손으로 가볍게 섞어 얼음 계속.
8. 5 단계에서 소화 세포 5μL를 타고 부드럽게 장소는 미리 표시 YPD 판의 inoculum 지역에서 일렬로 방울.
9. 간신히 한천과 접촉하는 동안 매우 부드럽게 라인 방울 1-3 시간을 확산하기 위해 멸균 3mm 접종 루프를 사용합니다.
10. (7 단계가 생략되면, 이것은 외부 세포 벽의 소화가 감소하거나 중단 될 때) 한천로 흡수하는 액체를 허용합니다. 해부 현미경으로 진행합니다.

Asci의 해부
프로토콜

다음과 같은 프로토콜 가수 MSM 시스템 200 미세 현미경에 대한 설명입니다. 이 프로토콜은 이러한 자이스 혈구 micromanipulator MR로 수동 micromanipulator를 사용하는 경우 약간의 수정을 따라 수 있습니다.

1. 필드의 절반이 세포를 포함하고 절반 비어있는 접시의 지역에 중점을두고 있습니다. 천천히 그것이 필드의 빈 영역을 만지는 것과 같은 초점에 바늘을 가지고. 이것은 바늘이 이전 사용의 세포를 포함하지 않도록합니다. 바늘과 한천 사이의 연락은 서서히 초점에 와서 어두운 블랙 서클으로 여겨진다.
2. 위치 A1에서 매트릭스로 이동하여 다시 한천을 천공하여 표시를합니다. 이것이 완성되기 전에 현미경을 촬영하는 경우에는 접시의 방향을 결정하는 것입니다.
3. 검색 모드로 전환합니다. asci를 찾습니다. 가급적 세포가 잘 밖으로 보급되어 지역에 asci를 선택합니다. 셀 클러스터와 지역을 피한다. asci에서 네 가지 ascospores은 아직도 서로에게 부착해야합니다. 두 ascospores은 다른 두보다 약간 클 수 있습니다. 한 ascospore 줄을과 ascospores의 나머지 부분에 연결되어 있지 asci을 채취하지 마십시오.
4. 바늘로 자낭을 선택하십시오. 천천히 접시에 바늘을 가져와. microneedle의 그림자가 보인다, 라인 자낭이 최대가 뽑힐 수 있습니다. 서클 (바늘 끝)의 검은 외곽선이 볼 때까지 다시는 바늘을 접근한다. 이 원형으로 tetrad을 터치하고 신속하게 거리에 바늘을 가져옵니다. 자낭에서 네 명 모두 ascospores가 바늘을 준수하고 추가 세포이 자낭의 일부가 아닌 microneedle에서 수집하지 않은 것을 가지고 있는지 확인합니다.
5. 멀리 접시에서 microneedle를 당겨와 매트릭스 (처음 자낭위한 이동로 이동위치 A1). 자낭이 이전 각 위치를 기록해 둡니다. microneedle과 접시를 감동 넷 모두 ascospores은 microneedle를 올 때까지 돌아서하여 자낭을 놓으십시오. 바늘을 암 또는 YPD 접시를 들고 플랫폼의 부드러운 감청이 단계에서 종종 유용합니다.
6. asci의 원하는 번호가 잡았 때까지 3-5 단계와 매트릭스에서 연속 위치에 자리 asci를 반복합니다.
7. 각각의 자낭에 다시 가서 부드럽게 플랫폼 또는이 둘의 조합을 도청, 바늘로 괴롭히고하여 분리 네 개의 세포를 휴식. 각각의 자낭 각 ascospore 네개가의 행을 분리 때까지 모체의 새로운 위치에 뒤에 하나를두고 세포를 선택하십시오.
8. ° C의 성장 패턴을 관찰하기 위해 몇 일 동안 30 인큐베이터에서 YPD 접시를 놓습니다.
9. 복제 플레이트 선택 매체 필요한 경우에 해부 세포.

Zygotes의 이주
프로토콜

1. 하나의 식민지를 얻을 수있는 적절한 매체에 반대 짝짓기 유형 두 개의 haploid 종자 밖으로 승리.
2. 메이트이 두 계통은 위에서 설명한, 4 일에서 6 시간 (또는 야간 필요한 경우)에서 성장 수 있습니다.
3. 가벼운 현미경 zygotes 있는지 확인합니다. Zygotes 중 하나 또는 버드없이 아령 모양의 세포로 나타납니다.
4. 3mm 접종 루프 (세포가 루프의 ¼을 커버한다)와 세포를 들고 살균 DH ₂ O.의 100μL에 부드럽게 장소
5. YPD 접시에 inoculum 지역의 상단과 하단을 표시합니다.
6. 5μL 타고 부드럽게 장소는 미리 표시 YPD 판의 inoculum 지역에서 일렬로 방울.
7. 간신히 한천과 접촉하는 동안 매우 부드럽게 라인에 방울을 확산하기 위해 3mm 접종 루프를 사용합니다.
8. 액체 배지에 흡수하도록 허용합니다. 해부 현미경으로 진행합니다.
9. 필드의 절반이 세포를 포함하고 절반 비어있는 접시의 지역에 중점을두고 있습니다. 천천히 그것이 필드의 빈 영역을 만지는 것과 같은 초점에 바늘을 가지고. 이것은 바늘이 이전 사용의 세포를 포함하지 않도록합니다. 바늘과 한천 사이의 연락은 서서히 초점에 와서 어두운 블랙 서클으로 여겨진다.
10. 위치 A1에서 매트릭스로 이동하여 다시 한천을 천공하여 표시를합니다. 이것이 완성되기 전에 현미경을 촬영하는 경우에는 접시의 방향을 결정하는 것입니다.
11. 검색 모드로 전환합니다. 접합자를 찾습니다.
12. 바늘로 접합자를 선택하십시오.
13. 장소는 매트릭스에 개별적으로 zygotes.
14. zygotes 몇 일 동안 성장할 수 있습니다.
15. 적절한 선택 매체에 복제 판은 zygotes.

대표 결과

그림 1 : 반대 짝짓기 유형의 두 haploid 변종의 짝짓기는 diploid 변형을 생성합니다.

그림 2 : 온도에 민감한 변형 (leu2 auxotrophy)와 야생 유형 스트레인 (LEU2) 사이에 짝짓기의 thre 결과 (A) YPD 플레이트. 소화 세포는 두 흑인 라인 사이의 두꺼운 성장을 볼 수 있습니다 왼쪽에있는 inoculum 지역에 보급하고 있습니다. 해부했습니다 Asci가 균일하게 오른쪽에 매트릭스의 간격 성장. (B) (A)의 접시는 SD - 류신 드롭 아웃 플레이트에 복제되었습니다. 확인 ascospore이 해부되었다 나타내는 LEU2 마커에 대한 2시 2분 성장을합니다. (C) (A)의 번호판은 YPD 접시에 복제와 37 ° C.에 incubated되었습니다 더 ascospore가 해부하는 것을 검증 2시 2분 성장을합니다.

Discussion

효모 해부 원하는 마커 새로운 변종을 선택하는 유용한 도구입니다. 네 ascospores의 이론적인 성장 패턴을 결정할 때 그것은 식물 세포의 유전자형 보는 것이 중요합니다. 플라스미드가 있으면이 ascospore (들)은 플라스미드를 받고 조작되는 변종에 대한 예측과 결론에 영향을 미칠 수있는 영향을 줄 수로가 하나의 낮은 또는 높은 복사하는 경우, 하나는 알고 있어야합니다.

일부 변종은 시간의 짧은 기간에 많은 ascospores 생산 다른 사람보다 sporulate 수 있습니다. 다른 변종은 ascospores의 낮은 비율을 얻을 수 있습니다. 이 정도로 진정한 asci 선택할 수있는 한 실험에 어떤 영향을 미칠 수 없습니다. 또한, 계통 세포 벽 소화하는 동안 다른 반응 그리고 그것은 경험적으로 tetrad 주스의 배양 시간을 조정할 필요가 있습니다.

원하는 마커와 세포를 선택할 때, 하나는 모든 ascospores의 성장 패턴은 이론적으로 성장 패턴에 해당하는 asci에서 모든 ascospores의 대다수가 예상되는 성장 패턴을 초래할 해부에서 온 이들을 선택해야합니다.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Singer MSM System 200	Microscope	Singer Instruments	NA
D-sorbitol	Reagent	BioShop Canada	SOR508
Tris	Reagent	BioShop Canada	TRS001
Zymolyase 100T	Reagent	Seikagaku Corporation	120493
Yeast extract	Reagent	BioShop Canada	YEX401
Peptone	Reagent	BioShop Canada	PEP 403
D-glucose	Reagent	BioShop Canada	GLU501
Yeast nitrogen base	Reagent	BioShop Canada	YNB406
Bio-tryptone	Reagent	BioShop Canada	TRP402
Sodium chloride	Reagent	BioShop Canada	SOD002
Potassium acetate	Reagent	BioShop Canada	POA 301
Agar	Reagent	BioShop Canada	AGR003
Adenine sulfate	Reagent	BioShop Canada	ADS201
L-uracil	Reagent	BioShop Canada	URA 241
L-tryptophan	Reagent	BioShop Canada	TRP 100
L-histidine	Reagent	BioShop Canada	HIS 200
L-arginine	Reagent	Amresco	0877-100G
L-methionine	Reagent	BioShop Canada	MET 222
L-tyrosine	Reagent	BioShop Canada	TYR 333
L-isoleucine	Reagent	BioShop Canada	ISO 910
L-valine	Reagent	BioShop Canada	VAL 201
L-lysine	Reagent	BioShop Canada	LYS 101
L-phenylalanine	Reagent	BioShop Canada	PHA 302
L-glutamic acid	Reagent	BioShop Canada	GLU 202
L-threonine	Reagent	BioShop Canada	THR002
L-leucine	Reagent	BioShop Canada	LEU 222