Diseksiyonu Saccharomyces cerevisiae Asci

Summary

Maya hücreleri Mikromanipülasyon diploid zigot seçmek için mayotik genetik analiz için gerekli. Bu micromanipulations diseksiyon mikroskobu microneedle kullanılarak yürütülmektedir. Microneedle, hücreleri taşınmaya kullanılır ve otomasyon çeşitli derecelerde mevcuttur mikromanipülatör tarafından kontrol edilir.

Abstract

Maya, son derece uysal bir model sistem birçok farklı hücresel süreçleri incelemek için kullanılır. Ortak bir laboratuvar suşu

Protocol

Diploid suşları İnşaatı
Çiftleşme tarafından diploitler üretimi için protokol

1. Ilk suşları YPD, ya da seçici besiyeri gerekirse, tek koloniler halinde dışarı vurdu olmalıdır. Iki haploid suşları, tam tersi çiftleşme tipi (yani Mata ve MATα) olmalıdır.
2. , Kısır bir aşılama döngü kullanarak iki haploid suşların biri bir koloni küçük bir bölümünü seçin. Yeni bir YPD plaka çizgi döngü bir kez plaka üzerinde düz bir çizgi üzerinde. Plakanın alt tarafında bir ok ile bir çizgi yönünde işaretleyin.
3. Aynı YPD plaka ikinci suşu için bu işlemi tekrarlayın. Bu kez ilk koloni dik çizgi, ilk çizgi ikinci kapısı. Ikinci bir çizgi yönünde Mark ve ikinci çizgi ilk haçlar alan unutmayın. Bu alan diploitler nerede üretilecek olacaktır.
4. 30 ° C gecede YPD plaka inkübe edin.
5. Replica plaka seçici ortama YPD plaka seçici yeni kurulan diploitler büyüme izin verecektir.
6. Tek koloniler oluşturmak için aynı seçici besiyeri üzerine tek bir koloni, eğer mümkünse, ya da diploid çizgi ve çizginin küçük bir bölümünü seçin.

Asci Sporlanma ve sindirim
Protokol

1. Yukarıdaki plaka tek koloniler seçin ve (1cm x 1cm) sporlanma (DPT) plakaları yamaları küçük yapmak ve biçime girdiklerinde için 3-7 gün süreyle 30 ° C'de inkübe edin.
2. Sporlanma ışık mikroskobu altında her yama hücreleri bakarak kontrol edilebilir. Su 5-10 ul bir mikroskop lamı üzerine yerleştirin hücreleri, damlacık bir lamel üstüne yerleştirin ve asci varlığı bakın. Asci kolayca bulunmayan Eğer inkübatör geri koymak.
3. Yamalar etkili sporlanma varsa, dörtlü suyu 100μL ile 15 mL steril konik tüp hazırlar.
4. 3mm aşılama steril bir döngü (hücre döngü ¼ kapsamalıdır) ve dörtlü suyu yerine bu sporlanma yama hücreleri seçin. Yavaşça girdap hücreleri çözümü ile döngü ve karıştırın düşmek için izin döngü.
5. 4-10mins (zymolyase ve gerginlik, konsantrasyon ve aktivite bağlı olarak) tetrad suyu (zymolyase içeren) bırakın. Ascospores çevreleyen hücre duvarı sindirim sağlar.
6. YPD bir plaka üzerinde inokulum bölgenin alt ve üst işaretleyin.
7. İsteğe bağlı. Reaksiyon buz gibi steril dH ₂ O 1 ml ekleyerek kesilebilir Hücrelerin 5mins yerleşmek için izin ver. Süpernatantı çıkar 1mL sonra elle hafifçe karıştırın ve buz üzerinde tutmak.
8. Sindirilir hücrelerinin 5μL 5. adımı atın ve yavaşça yerine önceden işaretlenmiş YPD plaka inokulum bölgede bir hat düşer.
9. Steril bir 3mm aşılama döngü ancak agar ile temas yaparken çok nazik bir çizgi damla 1-3 kez yaymak için kullanın.
10. (Adım 7 atlanırsa, bu dış hücre duvarı sindirim azalır ya da durdurmak olacak) agar içine absorbe sıvı izin verin. Diseksiyon mikroskobu geçin.

Aşçı, diseksiyonu
Protokol

Şarkıcı MSM Sistemi 200 mikromanipülasyon mikroskop için açıklanan aşağıdaki protokol olduğunu unutmayın. Bu protokol bir Zeiss mikromanipülatör MR gibi manuel mikromanipülatör kullanıyorsanız küçük modifikasyonlar ile takip edilebilir.

1. Plaka alanının yarısı hücreleri içeren ve yarısı boş bir bölge odaklanın. Yavaş yavaş bu alanın boş bir bölgede dokunur böyle odak noktası haline iğne getirin. Bu iğne, bir önceki kullanımından hücreleri içermediğinden emin sağlayacaktır. İğne ve agar arasındaki temas, yavaş yavaş odak noktası haline gelen bir koyu siyah bir daire olarak görülür.
2. Pozisyon A1 matris gidin ve tekrar agar delici bir işareti yapmak. Bu mikroskop tamamlanmadan önce alınırsa plaka yönünü belirlemek yardımcı olmaktır.
3. Arama moduna geçer. Bir asci bulun. Tercihen hücreler yayılmış alanlarda asci seçin. Hücre kümeleri alanlardan kaçının. Bir asci dört ascospores hala birbirlerine bağlı olmalıdır. İki ascospores diğer ikisine göre biraz daha büyük olabilir. Bir ascospore gevşek ve ascospores geri kalanına bağlı değil asci toplama kaçının.
4. Iğne ile bir TSKB'ler Pick up. Yavaş yavaş plaka iğne kadar getirmek. microneedle gölgesi görülüyor, çizgi TSKB'ler bu kadar duyulabilir. Siyah bir daire (iğne ucu) anahat görüldüğü kadar yine iğne yaklaşım. Bu daire ile tetrad dokunun ve sonra çabucak iğneyi çekin. Bir TSKB'ler dört ascospores iğne uyulması ve herhangi bir ek hücreleri bu TSKB'ler parçası değildir microneedle toplandı emin olun.
5. Microneedle uzak plakadan çekin ve matris (ilk TSKB için, gidin gidinkonumu A1). TSKB'ler taşındı her pozisyonu dikkat edin. Microneedle plaka dokunmadan ve dört ascospores microneedle gelene kadar çekerek TSKB'ler aşağı gelecek şekilde yerleştirin. Nazik iğne kol veya YPD plaka tutan platform dokunarak bu adımı çok kullanışlıdır.
6. 3-5 adımları ve matris üzerine üst üste pozisyonlar yer asci aşağı asci, istenilen sayıda seçilmiş kadar tekrarlayın.
7. Her TSKB'ler geri dönün ve platform ya da her ikisinin kombinasyonu hafifçe dokunarak, iğne ile alay tarafından ayrı dört hücre kırmak. Kadar her TSKB'ler her ascospore dört satır ayrılmış matris yeni bir konuma geride bırakarak hücre seçin.
8. 30 ° C büyüme paterni gözlemlemek için birkaç gün için bir kuluçka YPD plaka koyun.
9. Replica plaka disseke hücrelerin seçici besiyeri gerekirse.

Zigot Taşınması
Protokol

1. Tek koloniler elde etmek için uygun bir ortam üzerinde ters çiftleşme tipleri ile iki haploit suşları dışarı Streak.
2. Mate bu iki uzamanın yukarıda açıklandığı gibi ve 4 ila 6 saat (ya da gerekirse bir gecede) büyümesine izin.
3. Zigot bir ışık mikroskobu altında olup olmadığını kontrol edin. Zigot ya veya bir tomurcuk olmadan dambıl şekilli hücreler olarak görünecektir.
4. 3mm aşılama döngü (hücre döngü ¼ kapsamalıdır) hücreleri Pick up ve steril dH ₂ O 100μL yavaşça yerine
5. YPD bir plaka üzerinde inokulum bölgenin alt ve üst işaretleyin.
6. 5μL alın ve yavaşça yerine önceden işaretlenmiş YPD plaka inokulum bölgede bir hat düşer.
7. 3mm bir aşılama döngü ancak agar ile temas yaparken çok nazik bir çizgi damla yaymak için kullanın.
8. Agar içine sıvı emmesine izin verin. Diseksiyon mikroskobu geçin.
9. Plaka alanının yarısı hücreleri içeren ve yarısı boş bir bölge odaklanın. Yavaş yavaş bu alanın boş bir bölgede dokunur böyle odak noktası haline iğne getirin. Bu iğne, bir önceki kullanımından hücreleri içermediğinden emin sağlayacaktır. İğne ve agar arasındaki temas, yavaş yavaş odak noktası haline gelen bir koyu siyah bir daire olarak görülür.
10. Pozisyon A1 matris gidin ve tekrar agar delici bir işareti yapmak. Bu mikroskop tamamlanmadan önce alınırsa plaka yönünü belirlemek yardımcı olmaktır.
11. Arama moduna geçer. Zigot bulun.
12. Iğne ile bir zigot Pick up.
13. Place matris üzerine tek tek zigot.
14. Zigot birkaç gün büyümesine izin verin.
15. Uygun seçici besiyeri üzerine Replica plaka zigot.

Temsilcisi Sonuçlar

Şekil 1: zıt eşleşme türleri iki haploid suşlarının çiftleşme diploid gerginlik üretir.

Şekil 2: (A), ısıya duyarlı bir suş (leu2 auxotrophy) ve vahşi bir tür zorlanma (LEU2) arasında bir çiftleşme thre sonuç ile YPD plaka . Sindirilmiş hücreleri iki siyah çizgiler arasında kalın bir büyüme görülür soldaki inokulum bölgede yayılır. Disseke edilmiş Asci eşit sağ tarafta matris aralıklı büyür. (B) (A) plaka bir SD-Leucine terk tabağa çoğaltılır. LEU2 belirteç için geçerli bir ascospore disseke gösteren 02:02 büyüme unutmayın. (C) (A) plaka YPD bir tabağa çoğaltılır ve 37 ° C'de inkübe edildi Daha bir ascospore disseke olduğunu doğrular 02:02 büyüme unutmayın.

Discussion

Maya diseksiyonu istenilen işaretleri ile yeni türler seçmek için yararlı bir araçtır. Dört ascospores teorik büyüme modelini belirlerken vejetatif hücre genotipi bakmak önemlidir. Bir plazmid varsa bu ascospore (ler) plazmid almak ve manipüle olan suşları ile ilgili tahmin ve sonuçları etkileyecek etkileyecek gibi, tek, düşük veya yüksek kopya ise, bilmeniz gerekir.

Bazı suşlarının diğerlerine göre daha kısa bir süre içinde birçok ascospores üreten iyi biçime girdiklerinde yapabilirsiniz. Diğer suşlar ascospores düşük bir yüzdesi verebilir. Bu yeterli olarak gerçek asci seçilebilir sürece deney üzerinde herhangi bir etkisi yoktur. Ayrıca, hücre duvarı sindirim sırasında suşları farklı yanıt ve ampirik tetrad suyu inkübasyon süresi ayarlamak için gereklidir.

İstenen işaretleri ile hücreleri seçerken, tek büyüme modeli tüm ascospores teorik büyüme paterni karşılık bir asci ve büyük bir çoğunluğu tüm ascospores beklenen büyüme paterni yol bir diseksiyon gelenlerin tercih etmelisiniz.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Singer MSM System 200	Microscope	Singer Instruments	NA
D-sorbitol	Reagent	BioShop Canada	SOR508
Tris	Reagent	BioShop Canada	TRS001
Zymolyase 100T	Reagent	Seikagaku Corporation	120493
Yeast extract	Reagent	BioShop Canada	YEX401
Peptone	Reagent	BioShop Canada	PEP 403
D-glucose	Reagent	BioShop Canada	GLU501
Yeast nitrogen base	Reagent	BioShop Canada	YNB406
Bio-tryptone	Reagent	BioShop Canada	TRP402
Sodium chloride	Reagent	BioShop Canada	SOD002
Potassium acetate	Reagent	BioShop Canada	POA 301
Agar	Reagent	BioShop Canada	AGR003
Adenine sulfate	Reagent	BioShop Canada	ADS201
L-uracil	Reagent	BioShop Canada	URA 241
L-tryptophan	Reagent	BioShop Canada	TRP 100
L-histidine	Reagent	BioShop Canada	HIS 200
L-arginine	Reagent	Amresco	0877-100G
L-methionine	Reagent	BioShop Canada	MET 222
L-tyrosine	Reagent	BioShop Canada	TYR 333
L-isoleucine	Reagent	BioShop Canada	ISO 910
L-valine	Reagent	BioShop Canada	VAL 201
L-lysine	Reagent	BioShop Canada	LYS 101
L-phenylalanine	Reagent	BioShop Canada	PHA 302
L-glutamic acid	Reagent	BioShop Canada	GLU 202
L-threonine	Reagent	BioShop Canada	THR002
L-leucine	Reagent	BioShop Canada	LEU 222