Dissecção da Saccharomyces cerevisiae Asci

Summary

Micromanipulação de células de levedura é necessária para a análise genética meiótica ou para selecionar zigotos diplóides. Estes micromanipulations são realizadas com a microneedle de um microscópio de dissecação. O microagulhas é usado para deslocar as células e é controlado por um micromanipulador, que estão disponíveis com vários graus de automação.

Abstract

A levedura é um sistema modelo altamente tratável que é usado para estudar diversos processos celulares. A cepa comum de laboratório

Protocol

Construção de linhagens diplóides
Protocolo para a produção de diplóides de reprodução sexuada

1. As cepas inicial deve ser riscado em meio YPD, ou seletivos, se necessário, para produzir colônias único. As duas cepas haplóides deve ser do tipo de acasalamento oposto (isto é, MATA e MATα).
2. Usando um loop de inoculação estéril escolher uma pequena porção de uma colônia de uma das duas estirpes haplóides. Em uma raia novo prato YPD o loop uma vez em uma linha reta ao longo da placa. Marca a direção da raia com uma seta na parte inferior da placa.
3. Repita este procedimento para a segunda estirpe na mesma placa YPD. Desta vez, a raia colônia perpendicular à primeira, cruzando a raia em primeiro lugar com o segundo. Marca a direção da raia segundo e observe a área onde a raia segundo atravessa o primeiro. Esta área será diplóides, onde será produzido.
4. Incubar a placa de YPD a 30 ° C durante a noite.
5. Réplica da placa da placa de YPD em mídia seletiva que irá permitir seletivamente o crescimento do diplóides recém-formado.
6. Escolha uma única colônia, se possível, ou uma pequena parte do raia diplóides e raia para o mesmo meio seletivo para gerar colônias único.

Esporulação e digestão dos ascos
Protocolo

1. Escolha colônias único da placa acima e fazer pequenos (1cm x 1cm) manchas na esporulação (SPO) placas e incubar a 30 ° C por 3-7 dias para esporular.
2. Esporulação pode ser verificado, olhando para as células de cada patch em microscópio de luz. Células lugar numa lâmina de microscópio, em mL 50-10 de água, coloque uma lamela em cima da gota, e olhar para a presença de ascos. Se ascos não são facilmente encontrados em seguida, colocar de volta na incubadora.
3. Se houver esporulação eficaz em um dos patches, preparar um tubo cônico estéril 15mL com 100μL de suco de tétrade.
4. Escolha as células a partir deste patch esporulação com um laço de inoculação estéril 3mm (células deve cobrir ¼ do ciclo) e coloque o suco de tétrade. Agite suavemente o loop para permitir que as células a cair do laço e misture com a solução.
5. Deixe no suco de tétrade (contendo zymolyase) para 4-10mins (dependendo da concentração e atividade de zymolyase ea tensão em si). Isto permite a digestão da parede celular em torno do ascósporos.
6. Marcar a parte superior e inferior da região de inóculo em uma placa de YPD.
7. Opcional. Reação pode ser interrompida pela adição de 1mL de gelada estéril dH ₂ O. Permitir que as células de se contentar com 5mins. Remover 1mL do sobrenadante em seguida, misture levemente com a mão e manter em gelo.
8. Tome 5μL de células digerida a partir do passo 5 e coloque delicadamente gotas em uma linha na região de inóculo da placa pré-marcada YPD.
9. Use um loop de inoculação estéril 3mm a muito delicadamente espalhar os tempos 1-3 gotas em uma linha, enquanto apenas fazer contato com o ágar.
10. Deixe o líquido absorver no agar (Se a etapa 7 é omitido, isto é, quando a digestão da parede celular externa será reduzida ou stop). Proceder ao microscópio de dissecação.

Dissecção da Asci
Protocolo

Note que o protocolo a seguir é descrito para um Sistema de Cantor MSM microscópio de micromanipulação 200. Este protocolo pode ser seguido com ligeiras modificações, se usando um micromanipulador manuais, tais como um micromanipulador Zeiss MR.

1. Concentre-se em uma região da placa onde a metade do campo contém células e meio está vazio. Traga lentamente a agulha em foco de tal forma que ele toca a região vazia do campo. Isso irá garantir que a agulha não contém células de um uso anterior. Contato entre a agulha eo agar é visto como um círculo preto escuro que lentamente entra em foco.
2. Ir para a matriz na posição A1 e faça uma marca, perfurando o ágar novamente. Isto é para ajudar a determinar a orientação da placa, se for retirado o microscópio antes da conclusão.
3. Mude para o modo de busca. Localizar um ascos. Preferencialmente escolher ascos que estão em áreas onde as células estão bem espalhados. Evitar áreas com aglomerados de células. Os quatro ascósporos de um ascos ainda deve ser anexado a outro. Dois ascósporos podem ser ligeiramente maior que os outros dois. Evitar a captação ascos onde se ascósporos está solto e não está ligado ao resto dos ascósporos.
4. Pegar um ascus com a agulha. Traga lentamente a agulha até a placa. Quando a sombra da microagulhas é visto line, isto com o ascus para ser escolhido. Novamente abordagem a agulha até o contorno de um círculo preto (a ponta da agulha) é visto. Toque na tétrade com este círculo e, em seguida, retire rapidamente a agulha para longe. Certifique-se de todos os quatro ascósporos de um ascus aderiram à agulha e que não há células adicionais foram recolhidas no microagulhas que não fazem parte deste ascus.
5. Puxe a microneedle longe do prato e ir para a matriz (para o ascus primeiro, vá paraposição A1). Tome nota de cada posição onde uma ascus é realocado. Coloque o ascus para baixo, tocando a placa com o microagulhas e afastando-se até que os quatro ascósporos sair do microagulhas. Tocando suave do braço agulha ou plataforma segurando a placa de YPD é frequentemente útil nesta etapa.
6. Repita os passos 3-5 e ascos lugar para baixo em posições consecutivas na matriz até o número desejado de ascos foram escolhidos.
7. Voltar a cada ascus e quebrar a quatro células separadas por provocação com a agulha, tocando suavemente a plataforma ou uma combinação de ambos. Pegar as células deixando um para trás em uma nova posição na matriz até que cada ascósporos em cada ascus é separado em linhas de quatro.
8. Coloque a placa de YPD em uma incubadora a 30 ° C durante vários dias para observar o padrão de crescimento.
9. Réplica da placa as células dissecados para meio seletivo, se necessário.

Relocalização de zigotos
Protocolo

1. Expelido duas cepas haplóides com os tipos de acasalamento opostos sobre o meio adequado para obter colónias isoladas.
2. Companheiro destas duas estirpes, como descrito acima e deixe crescer de 4 a 6 horas (ou durante a noite se necessário).
3. Verifique se há zigotos em microscópio de luz. Zigotos aparecerá como dumbbell em forma de células, com ou sem um broto.
4. Escolha as células com um loop de inoculação 3mm (células deve cobrir ¼ do ciclo) e coloque delicadamente em 100μL de estéril dH ₂ O.
5. Marcar a parte superior e inferior da região de inóculo em uma placa de YPD.
6. Tome 5μL e coloque delicadamente gotas em uma linha na região de inóculo da placa pré-marcada YPD.
7. Use um loop inoculação 3mm a espalhar as gotas em uma linha muito suavemente, enquanto apenas fazer contato com o ágar.
8. Deixe o líquido absorver no agar. Proceder ao microscópio de dissecação.
9. Concentre-se em uma região da placa onde a metade do campo contém células e meio está vazio. Traga lentamente a agulha em foco de tal forma que ele toca a região vazia do campo. Isso irá garantir que a agulha não contém células de um uso anterior. Contato entre a agulha eo agar é visto como um círculo preto escuro que lentamente entra em foco.
10. Ir para a matriz na posição A1 e faça uma marca, perfurando o ágar novamente. Isto é para ajudar a determinar a orientação da placa, se for retirado o microscópio antes da conclusão.
11. Mude para o modo de busca. Localizar um zigoto.
12. Pegar um zigoto com a agulha.
13. Lugar zigotos individualmente na matriz.
14. Permitir zigotos a crescer por vários dias.
15. Placa réplica do zigotos para o meio apropriado seletivo.

Resultados representante

Figura 1: O cruzamento de duas linhagens haplóides de tipos de acasalamento oposto gera uma linhagem diplóide.

Figura 2: (A) A placa de YPD com resultados thre de um cruzamento entre uma cepa sensível à temperatura (com um auxotrophy leu2) e uma cepa selvagem (LEU2). Células digeridos são distribuídos na região de inóculo do lado esquerdo, onde o crescimento de espessura entre as duas linhas pretas é visto. Ascos que foram dissecados crescer uniformemente espaçados na matriz à direita. (B) A placa de (A) foi replicado em um SD-Leucina placa de abandono. Observe o crescimento 2:02 para o marcador LEU2 indicando uma ascósporos validado foi dissecado. (C) A placa de (A) foi replicada em uma placa YPD e incubadas a 37 ° C. Observe o crescimento 2:02 que valida ainda mais que um ascósporos foi dissecado.

Discussion

Dissecção levedura é uma ferramenta útil para selecionar novas cepas com marcadores desejada. Ao determinar o padrão de crescimento teórico de quatro ascósporos, é importante olhar para o genótipo da célula vegetativa. Se um plasmídeo está presente, é preciso saber se é exemplar único, baixa ou alta, pois isso afetará quais ascósporos (s) receberá o plasmídeo e vai afetar as previsões e conclusões sobre as cepas sendo manipulado.

Certas cepas podem esporular melhor do que outros produzem ascósporos muitos em um curto período de tempo. Outras linhagens só podem produzir um baixo percentual de ascósporos. Isto não tem qualquer efeito sobre o experimento, enquanto o suficiente ascos verdade pode ser selecionado. Além disso, linhagens respondem de forma diferente durante a digestão da parede celular e é necessário ajustar empiricamente o tempo de incubação no suco tétrade.

Ao selecionar células com os marcadores desejados, deve-se escolher apenas aqueles que vêm de uma ascos, onde o padrão de crescimento de todos os ascósporos correspondem ao padrão de crescimento teórico e de uma dissecção onde a grande maioria de todos os ascósporos levar ao padrão de crescimento esperado.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Singer MSM System 200	Microscope	Singer Instruments	NA
D-sorbitol	Reagent	BioShop Canada	SOR508
Tris	Reagent	BioShop Canada	TRS001
Zymolyase 100T	Reagent	Seikagaku Corporation	120493
Yeast extract	Reagent	BioShop Canada	YEX401
Peptone	Reagent	BioShop Canada	PEP 403
D-glucose	Reagent	BioShop Canada	GLU501
Yeast nitrogen base	Reagent	BioShop Canada	YNB406
Bio-tryptone	Reagent	BioShop Canada	TRP402
Sodium chloride	Reagent	BioShop Canada	SOD002
Potassium acetate	Reagent	BioShop Canada	POA 301
Agar	Reagent	BioShop Canada	AGR003
Adenine sulfate	Reagent	BioShop Canada	ADS201
L-uracil	Reagent	BioShop Canada	URA 241
L-tryptophan	Reagent	BioShop Canada	TRP 100
L-histidine	Reagent	BioShop Canada	HIS 200
L-arginine	Reagent	Amresco	0877-100G
L-methionine	Reagent	BioShop Canada	MET 222
L-tyrosine	Reagent	BioShop Canada	TYR 333
L-isoleucine	Reagent	BioShop Canada	ISO 910
L-valine	Reagent	BioShop Canada	VAL 201
L-lysine	Reagent	BioShop Canada	LYS 101
L-phenylalanine	Reagent	BioShop Canada	PHA 302
L-glutamic acid	Reagent	BioShop Canada	GLU 202
L-threonine	Reagent	BioShop Canada	THR002
L-leucine	Reagent	BioShop Canada	LEU 222