Dissectie van Saccharomyces Cerevisiae Asci

Summary

Micromanipulatie van de gistcellen is nodig voor de meiose genetische analyse of om diploïde zygoten te selecteren. Deze micromanipulations worden uitgevoerd met behulp van de microneedle van een dissectie microscoop. De microneedle wordt gebruikt om de cellen te verplaatsen en wordt gecontroleerd door een micromanipulator die beschikbaar zijn met een verschillende mate van automatisering.

Abstract

Gist is een zeer soepel model systeem dat wordt gebruikt om veel verschillende cellulaire processen te bestuderen. De gemeenschappelijke stam laboratorium

Protocol

Bouw van diploïde stammen
Protocol voor de productie van diploïden door voortplanting

1. De initiële stammen moeten worden geslagen op YPD, of selectief medium, indien nodig, om enkele kolonies te produceren. De twee haploïde stammen moeten zijn van tegengestelde mating type (dwz Mata en MATα).
2. Met behulp van een steriele enting lus kies een klein deel van een kolonie van een van de twee haploïde stammen. Op een nieuwe plaat YPD streep de lus een keer in een rechte lijn over de plaat. Markeer de richting van de streep met een pijl op de onderzijde van de plaat.
3. Herhaal dit voor de tweede stam op dezelfde YPD plaat. Dit keer streak de kolonie loodrecht op de eerste, kruising de eerste streep met de tweede. Markeer de richting van de tweede streep en let op het gebied waar de tweede streep passeert de eerste. Dit gebied zal zijn waar diploïden zullen worden geproduceerd.
4. Incubeer de plaat YPD bij 30 ° C gedurende de nacht.
5. Replica bord van de YPD plaat op selectieve media die selectief zal het mogelijk de groei van de pas gevormde diploïden.
6. Kies een enkele kolonie indien mogelijk, of een klein deel van de diploïde streep en streep op dezelfde selectieve medium om enkele kolonies te genereren.

Sporulatie en de vertering van ASCI
Protocol

1. Pick enkele kolonies van de plaat boven en maak kleine (1 cm x 1 cm) vlekken op sporulatie (SPO) platen en incubeer bij 30 ° C voor 3-7 dagen naar sporulate.
2. Sporulatie kan worden gecontroleerd door te kijken naar cellen van elke patch onder een lichtmicroscoop. Plaats cellen op een objectglaasje 5-10 ul van water, plaats een dekglaasje op de top van de druppel, en zoek naar de aanwezigheid van ASCI. Als ASCI zijn niet gemakkelijk te vinden dan weer in de incubator.
3. Als er effectief sporulatie in een van de patches, bereiden een steriele 15 ml conische buis met 100μL van tetrade sap.
4. Pick up van deze cellen sporulatie patch met een steriele 3mm enting lus (cellen moet ¼ van de loop te dekken) en plaats in het viertal sap. Zwenk de lus om de cellen te vallen uit de lus en meng met de oplossing.
5. Laat in tetrade sap (met zymolyase) voor 4-10 minuten (afhankelijk van de concentratie en activiteit van zymolyase en de stam zelf). Dit maakt voor de spijsvertering van de celwand rond de ascosporen.
6. Markeer de boven-en onderkant van het inoculum regio op een YPD plaat.
7. Optioneel. Reactie kan worden gestopt door toevoeging van 1 ml van ijs koude steriele dH ₂ O. Laat de cellen om zich te vestigen voor 5mins. Verwijder 1 ml van het supernatant dan licht mengen met de hand te houden en op ijs.
8. Neem 5μL van verteerd cellen van stap 5 en voorzichtig plaats druppels in een lijn in het inoculum gebied van de pre-gemarkeerde YPD plaat.
9. Gebruik een steriele 3mm enting lus om heel voorzichtig verspreiding van de druppels 1-3 maal in een lijn, terwijl nauwelijks contact maken met de agar.
10. Laat de vloeistof te absorberen in de agar (Als stap 7 is weggelaten, dit is wanneer de spijsvertering van de buitenste celwand zal worden verlaagd stoppen of). Ga verder naar de dissectie microscoop.

Dissectie van Asci
Protocol

Merk op dat de volgende protocol wordt beschreven voor een Singer MSM System 200 micromanipulatie microscoop. Dit protocol kan worden gevolgd met lichte wijzigingen bij gebruik van een handmatige micromanipulator, zoals een Zeiss micromanipulator MR.

1. Focus op een gebied van de plaat waar de helft van het veld bevat cellen en half leeg is. Langzaam breng de naald in beeld zodanig dat het de lege gebied van het veld raakt. Dit zal ervoor zorgen dat de naald geen cellen van een eerder gebruik bevatten. Contact tussen de naald en de agar wordt gezien als een donkere zwarte cirkel die langzaam komt in beeld.
2. Ga naar de matrix op positie A1 en maak een merk door het doorboren van de agar opnieuw. Dit is om de oriëntatie van de plaat te bepalen of het wordt genomen uit de microscoop voor de voltooiing.
3. Schakel over naar de zoekmodus. Zoek een ASCI. Kies bij voorkeur ASCI die in gebieden waar de cellen goed verspreid. Vermijd gebieden met cel-clusters. De vier ascosporen van een asci moet nog steeds worden aan elkaar bevestigd. Twee ascosporen kan iets groter dan de andere twee. Vermijd plukken ASCI waar een ascospore is los en niet verbonden met de rest van de ascosporen.
4. Pick-up een ASCUS met de naald. Langzaam breng de naald tot aan de plaat. Wanneer de schaduw van de microneedle wordt gezien, lijn deze met de ASCUS om geplukt te worden. Opnieuw aanpak van de naald tot de zwarte omtrek van een cirkel (de punt van de naald) wordt gezien. Raak het viertal met deze cirkel en vervolgens snel weg te trekken van de naald. Zorg ervoor dat alle vier de ascosporen van een ASCUS hebben gehandeld op grond van de naald en dat er geen extra cellen werden verzameld op de microneedle die geen deel uitmaken van deze ASCUS.
5. Trek de microneedle ver weg van de plaat en ga naar de matrix (voor de eerste ASCUS, ga naarpositie A1). Kennis te nemen van elke positie waar een ASCUS is verplaatst. Plaats de ASCUS door het aanraken van de plaat met de microneedle en wegrijden totdat alle vier de ascosporen komen uit de microneedle. Zachte tikken van de naald arm of het platform die de YPD plaat is vaak handig bij deze stap.
6. Herhaal stappen 3-5 en plaats asci neer op opeenvolgende posities op de matrix totdat het gewenste aantal asci zijn geplukt.
7. Ga terug naar elke ASCUS en los te breken van de vier cellen van plagen met de naald, het aanboren van het platform voorzichtig of een combinatie van beide. Pak de cellen het verlaten van een achter op een nieuwe positie in de matrix tot elke ascospore in elk ASCUS wordt gescheiden in rijen van vier.
8. Plaats de YPD plaat in een incubator bij 30 ° C gedurende enkele dagen om de groei patroon te observeren.
9. Replica bord van de ontleed cellen selectief medium indien nodig.

Verhuizing van Zygoten
Protocol

1. Streak uit twee haploïde stammen met een tegengestelde voortplantingstypes op het geschikte medium om enkele kolonies te krijgen.
2. Mate van deze twee stammen zoals hierboven beschreven en laten groeien van 4 tot 6 uur (of 's nachts indien nodig).
3. Controleer of er zygoten onder een lichtmicroscoop. Zygoten zal verschijnen als halter-vormige cellen met of zonder een knop.
4. Pick-cellen met een 3mm enting lus (cellen moet ¼ van de loop te dekken) en plaats zachtjes in 100μL van steriele dH ₂ O.
5. Markeer de boven-en onderkant van het inoculum regio op een YPD plaat.
6. Neem 5μL en voorzichtig plaats druppels in een lijn in het inoculum gebied van de pre-gemarkeerde YPD plaat.
7. Gebruik een 3mm enting lus om de druppels in een lijn zich heel voorzichtig, terwijl nauwelijks contact maken met de agar.
8. Laat de vloeistof te absorberen in de agar. Ga verder naar de dissectie microscoop.
9. Focus op een gebied van de plaat waar de helft van het veld bevat cellen en half leeg is. Langzaam breng de naald in beeld zodanig dat het de lege gebied van het veld raakt. Dit zal ervoor zorgen dat de naald geen cellen van een eerder gebruik bevatten. Contact tussen de naald en de agar wordt gezien als een donkere zwarte cirkel die langzaam komt in beeld.
10. Ga naar de matrix op positie A1 en maak een merk door het doorboren van de agar opnieuw. Dit is om de oriëntatie van de plaat te bepalen of het wordt genomen uit de microscoop voor de voltooiing.
11. Schakel over naar de zoekmodus. Zoek een zygote.
12. Pick-up een zygote met de naald.
13. Plaats zygoten individueel op de matrix.
14. Laat zygoten te groeien voor meerdere dagen.
15. Replica bord van de zygoten op het geschikte selectieve voedingsbodem.

Representatieve resultaten

Figuur 1: De paring van twee haploïde stammen van tegengestelde voortplantingstypes genereert een diploïde stam.

Figuur 2: (A) Een YPD plaat met thre de resultaten van een paring tussen een temperatuur gevoelige stam (met een leu2 auxotrofie) en een wild-type stam (LEU2). Verteerd cellen zijn verspreid in de regio inoculum aan de linkerkant waar de dichte groei tussen de twee zwarte lijnen wordt gezien. ASCI die zijn ontleed groeien gelijkmatig in de matrix aan de rechterkant. (B) De plaat (A) werd gerepliceerd op een SD-Leucine drop-out plaat. Let op de 2:02 groei voor de LEU2 marker wijst op een gevalideerd ascospore werd ontleed. (C) De plaat (A) werd gerepliceerd op een YPD plaat en geïncubeerd bij 37 ° C. Let op de 2:02 groei die verder valideert, dat een ascospore werd ontleed.

Discussion

Gist dissectie is een nuttig instrument om nieuwe stammen te selecteren met de gewenste markers. Bij het bepalen van de theoretische groeipatroon van vier ascosporen is het belangrijk om te kijken naar het genotype van het vegetatieve cel. Als er een plasmide aanwezig is, moet men weten of het is single, laag of hoog te kopiëren, omdat dit zal invloed hebben op die ascospore (s) het plasmide ontvangen en zullen van invloed zijn voorspellingen en de conclusies ten aanzien van de stammen wordt gemanipuleerd.

Sommige stammen kunnen sporulate beter dan de andere het produceren van vele ascosporen in een korte periode van tijd. Andere stammen kunnen geven maar een klein percentage van ascosporen. Dit heeft geen invloed op het experiment, zolang er voldoende waar asci kunnen worden geselecteerd. Bovendien stammen verschillend reageren tijdens de celwand spijsvertering en is het noodzakelijk om de incubatietijd empirisch aan te passen in het viertal sap.

Bij het selecteren van cellen met de gewenste markers, dient men alleen kiezen die afkomstig zijn uit een asci waar de groei patroon van alle ascosporen komen overeen met de theoretische groeipatroon en van een dissectie, waar de overgrote meerderheid van alle ascosporen leiden tot de verwachte groei patroon.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Singer MSM System 200	Microscope	Singer Instruments	NA
D-sorbitol	Reagent	BioShop Canada	SOR508
Tris	Reagent	BioShop Canada	TRS001
Zymolyase 100T	Reagent	Seikagaku Corporation	120493
Yeast extract	Reagent	BioShop Canada	YEX401
Peptone	Reagent	BioShop Canada	PEP 403
D-glucose	Reagent	BioShop Canada	GLU501
Yeast nitrogen base	Reagent	BioShop Canada	YNB406
Bio-tryptone	Reagent	BioShop Canada	TRP402
Sodium chloride	Reagent	BioShop Canada	SOD002
Potassium acetate	Reagent	BioShop Canada	POA 301
Agar	Reagent	BioShop Canada	AGR003
Adenine sulfate	Reagent	BioShop Canada	ADS201
L-uracil	Reagent	BioShop Canada	URA 241
L-tryptophan	Reagent	BioShop Canada	TRP 100
L-histidine	Reagent	BioShop Canada	HIS 200
L-arginine	Reagent	Amresco	0877-100G
L-methionine	Reagent	BioShop Canada	MET 222
L-tyrosine	Reagent	BioShop Canada	TYR 333
L-isoleucine	Reagent	BioShop Canada	ISO 910
L-valine	Reagent	BioShop Canada	VAL 201
L-lysine	Reagent	BioShop Canada	LYS 101
L-phenylalanine	Reagent	BioShop Canada	PHA 302
L-glutamic acid	Reagent	BioShop Canada	GLU 202
L-threonine	Reagent	BioShop Canada	THR002
L-leucine	Reagent	BioShop Canada	LEU 222