Dissection de Saccharomyces cerevisiae Asques

Summary

Micromanipulation des cellules de levure est nécessaire pour l'analyse génétique méiotique ou pour sélectionner les zygotes diploïdes. Ces micromanipulations sont effectuées en utilisant le micro-aiguille d'un microscope à dissection. La micro-aiguille est utilisée pour déplacer des cellules et est contrôlé par un micromanipulateur qui sont disponibles avec différents degrés d'automatisation.

Abstract

La levure est un système modèle très souple qui est utilisé pour étudier de nombreux processus cellulaires différents. La souche de laboratoire commun

Protocol

Construction de souches diploïdes
Protocole pour la production de diploïdes par accouplement

1. Les souches initiale doit être frappé sur milieu YPD, ou sélective, si nécessaire, pour produire des colonies isolées. Les deux souches haploïdes doit être de type sexuel opposé (c.-à-Mata et MATa).
2. En utilisant une boucle d'inoculation stériles ramasser une petite partie d'une colonie de l'un des deux souches haploïdes. Sur une strie plaque YPD nouvelle fois la boucle dans une ligne droite à travers la plaque. Repérer le sens de la ligne avec une flèche sur le bas de la plaque.
3. Répétez cette opération pour la deuxième souche sur la même plaque YPD. Cette fois-strie perpendiculaire à la première colonie, en traversant la strie premier avec le second. Repérer le sens de la strie secondes et noter la zone où le strie seconde traverse la première fois. Cette zone sera le lieu où diploïdes seront produites.
4. Incuber la plaque YPD à 30 ° C pendant la nuit.
5. Réplique de la plaque plaque YPD sur des milieux sélectifs qui permettent de façon sélective la croissance des diploïdes nouvellement formé.
6. Choisissez une seule colonie, si possible, ou une petite portion de la ligne diploïde et strie sur le même milieu sélectif pour générer des colonies isolées.

La sporulation et la digestion des asques
Protocole

1. Prélever des colonies unique à partir de la plaque au-dessus et faire des petits (1cm x 1cm) patchs sur la sporulation (SPO) plaques et incuber à 30 ° C pendant 3-7 jours à sporuler.
2. La sporulation peut être vérifié en regardant les cellules de chaque patch sous un microscope optique. Placez les cellules sur une lame de microscope dans ul 5-10 de l'eau, placer une lamelle sur le dessus de la goutte, et rechercher la présence d'asques. Si asques ne sont pas faciles à trouver ensuite remis dans l'incubateur.
3. S'il ya sporulation efficace dans l'un des correctifs, de préparer un tube de 15 ml stériles conique avec 100 pi de jus de tétrade.
4. Choisissez les cellules contre ce patch sporulation avec une boucle d'inoculation 3mm stérile (cellules devraient couvrir un quart de la boucle) et placer dans le jus de tétrade. Mélanger délicatement la boucle pour permettre aux cellules de se détacher de la boucle et mélanger avec la solution.
5. Laissez-les dans le jus de tétrade (contenant zymolyase) pour 4 à 10 minutes (selon la concentration et l'activité de zymolyase et la souche elle-même). Ceci permet pour la digestion de la paroi cellulaire entourant les ascospores.
6. Marquer le haut et le bas de la région d'inoculum sur une plaque YPD.
7. Facultatif. La réaction peut être stoppée en ajoutant 1 ml de glace froide stériles dH ₂ O. Permettre aux cellules de se contenter de 5 minutes. Retirer 1ml à partir du surnageant, puis mélanger délicatement à la main et de garder sur la glace.
8. Prenez 5uL de cellules digérées partir de l'étape 5 et placez doucement gouttes dans une ligne dans la région de l'inoculum de la plaque pré-marqués YPD.
9. Utilisez une boucle d'inoculation stérile 3mm à très doucement répandre la fois 1-3 gouttes dans une ligne tout juste de prendre contact avec l'agar-agar.
10. Laisser le liquide à absorber dans la gélose (Si l'étape 7 est omis, c'est à ce moment de la digestion de la paroi cellulaire externe sera réduit ou arrêt). Passez à la microscope à dissection.

Dissection d'Asques
Protocole

Notez que le protocole suivant est décrit pour un microscope Système Chanteur MSM micromanipulation 200. Ce protocole peut être suivie avec de légères modifications en cas d'utilisation d'un micromanipulateur manuelle comme un micromanipulateur Zeiss MR.

1. Focus sur une région de la plaque où la moitié du champ contient des cellules et l'autre moitié est vide. Porter lentement l'aiguille dans l'accent de telle sorte qu'il touche la région vide du champ. Cela permettra d'assurer que l'aiguille ne contiennent pas de cellules à partir d'un usage antérieur. Le contact entre l'aiguille et l'agar-agar est considéré comme un cercle noir foncé qui vient lentement dans le foyer.
2. Aller à la matrice à la position A1 et faire une marque en perçant la gélose à nouveau. C'est pour aider à déterminer l'orientation de la plaque si elle est prise hors du microscope avant la fin.
3. Passez en mode de recherche. Localiser un asques. De préférence, choisissez asques qui sont dans des zones où les cellules sont bien étalées. Évitez les zones avec des amas de cellules. Les quatre ascospores à partir d'un asques devrait toujours être attachés les uns aux autres. Deux ascospores peut être légèrement plus grand que les deux autres. Evitez la cueillette asques où l'on ascospores est lâche et pas connecté au reste de la ascospores.
4. Ramassez un asque avec l'aiguille. Porter lentement l'aiguille jusqu'à l'assiette. Quand l'ombre de la micro-aiguille est vu, la ligne de cette place avec l'asque à être cueillis. Encore une fois l'approche de l'aiguille jusqu'à ce que la silhouette noire d'un cercle (la pointe de l'aiguille) est vu. Touchez la tétrade avec ce cercle puis retirez rapidement l'aiguille loin. Assurez-vous que tous les quatre ascospores à partir d'un asque ont adhéré à l'aiguille et qu'aucune des cellules supplémentaires ont été recueillies sur la micro-aiguille qui ne font pas partie de cette asque.
5. Tirez sur la micro-aiguille loin de la plaque et aller à la matrice (pour l'asque d'abord, aller àposition A1). Prenez note de chaque position où un asque est déplacé. Placez l'asque par toucher la plaque avec la micro-aiguille et écartant jusqu'à ce que tous quatre ascospores se détacher de la micro-aiguille. Tapotant doucement sur le bras d'aiguille ou de la plate-forme maintenant la plaque YPD est souvent utile à cette étape.
6. Répétez les étapes 3-5 et le lieu asques bas à des positions consécutives sur la matrice jusqu'à ce que le nombre souhaité d'asques ont été cueillis.
7. Retournez à chaque asque et de briser les quatre cellules à part par des taquineries avec l'aiguille, en tapant la plate-forme en douceur ou une combinaison des deux. Ramassez les cellules laissant un derrière à une nouvelle position dans la matrice jusqu'à ce que chaque ascospores dans chaque asque est séparé en rangées de quatre.
8. Placer la plaque YPD dans un incubateur à 30 ° C pendant plusieurs jours pour observer le modèle de croissance.
9. Plaque Replica les cellules disséqué au milieu sélectif si nécessaire.

Relocalisation des zygotes
Protocole

1. Streak sur deux souches haploïdes de types sexuels opposés sur le support approprié pour obtenir des colonies isolées.
2. Maté ces deux souches comme décrit ci-dessus et permettent de passer de 4 à 6 heures (ou toute la nuit si nécessaire).
3. Vérifiez zygotes sous un microscope optique. Zygotes apparaîtra comme forme d'haltère cellules avec ou sans un bourgeon.
4. Choisissez les cellules avec une boucle d'inoculation 3mm (cellules devrait couvrir le quart de la boucle) et le placer délicatement dans 100 pi de stériles O. DH ₂
5. Marquer le haut et le bas de la région d'inoculum sur une plaque YPD.
6. Prenez 5uL et placez doucement gouttes dans une ligne dans la région de l'inoculum de la plaque pré-marqués YPD.
7. Utilisez une boucle d'inoculation 3mm pour diffuser les gouttes dans une ligne très doucement tout en peine de prendre contact avec l'agar-agar.
8. Laisser le liquide à absorber dans la gélose. Passez à la microscope à dissection.
9. Focus sur une région de la plaque où la moitié du champ contient des cellules et l'autre moitié est vide. Porter lentement l'aiguille dans l'accent de telle sorte qu'il touche la région vide du champ. Cela permettra d'assurer que l'aiguille ne contiennent pas de cellules à partir d'un usage antérieur. Le contact entre l'aiguille et l'agar-agar est considéré comme un cercle noir foncé qui vient lentement dans le foyer.
10. Aller à la matrice à la position A1 et faire une marque en perçant la gélose à nouveau. C'est pour aider à déterminer l'orientation de la plaque si elle est prise hors du microscope avant la fin.
11. Passez en mode de recherche. Localisez un zygote.
12. Ramassez un zygote avec l'aiguille.
13. Placez zygotes individuellement sur la matrice.
14. Autoriser les zygotes de croître pendant plusieurs jours.
15. Plaque Replica les zygotes sur le milieu sélectif approprié.

Les résultats représentatifs

Figure 1: L'accouplement de deux souches haploïdes de types sexuels opposés génère une souche diploïde.

Figure 2: (a) une plaque YPD avec des résultats thre d'un accouplement entre une souche sensible à la température (avec une auxotrophie leu2) et une souche de type sauvage (LEU2). Cellules digérées sont réparties dans la région de l'inoculum sur la gauche où la croissance épaisse entre les deux lignes noires est vu. Asci qui ont été disséqués croître régulièrement espacés dans la matrice sur la droite. (B) la plaque (A) a été reproduite sur une SD-leucine abandon assiette. Notez la croissance 2h02 pour le marqueur LEU2 indiquant une ascospores validé a été disséqué. (C) La plaque (A) a été reproduite sur une plaque YPD et incubées à 37 ° C. Notez la croissance 2h02 qui valide en outre qu'un des ascospores a été disséqué.

Discussion

Dissection La levure est un outil utile pour sélectionner de nouvelles souches avec des marqueurs souhaités. Lors de la détermination du modèle de croissance théorique de quatre ascospores, il est important de regarder le génotype de la cellule végétative. Si un plasmide est présent, il faut savoir s'il est seul exemplaire, faible ou forte que cela aura une incidence qui ascospores (s) de recevoir le plasmide et aura une incidence sur les prévisions et conclusions concernant les souches d'être manipulé.

Certaines souches peuvent sporuler mieux que d'autres produisant des ascospores nombreuses dans un court laps de temps. D'autres souches ne peuvent donner un faible pourcentage d'ascospores. Ceci ne veut pas avoir d'effet sur l'expérience aussi longtemps que suffisamment d'asques vraie peut être sélectionné. Par ailleurs, les souches réagissent différemment lors de la digestion paroi cellulaire et il est nécessaire d'ajuster empiriquement le temps d'incubation dans le jus de tétrade.

Lors de la sélection des cellules avec des marqueurs désiré, on doit seulement choisir celles qui viennent d'un asques où le modèle de croissance de tous les ascospores correspondent au modèle de croissance théorique et d'une dissection où la grande majorité de tous les ascospores mener à la courbe de croissance attendue.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Singer MSM System 200	Microscope	Singer Instruments	NA
D-sorbitol	Reagent	BioShop Canada	SOR508
Tris	Reagent	BioShop Canada	TRS001
Zymolyase 100T	Reagent	Seikagaku Corporation	120493
Yeast extract	Reagent	BioShop Canada	YEX401
Peptone	Reagent	BioShop Canada	PEP 403
D-glucose	Reagent	BioShop Canada	GLU501
Yeast nitrogen base	Reagent	BioShop Canada	YNB406
Bio-tryptone	Reagent	BioShop Canada	TRP402
Sodium chloride	Reagent	BioShop Canada	SOD002
Potassium acetate	Reagent	BioShop Canada	POA 301
Agar	Reagent	BioShop Canada	AGR003
Adenine sulfate	Reagent	BioShop Canada	ADS201
L-uracil	Reagent	BioShop Canada	URA 241
L-tryptophan	Reagent	BioShop Canada	TRP 100
L-histidine	Reagent	BioShop Canada	HIS 200
L-arginine	Reagent	Amresco	0877-100G
L-methionine	Reagent	BioShop Canada	MET 222
L-tyrosine	Reagent	BioShop Canada	TYR 333
L-isoleucine	Reagent	BioShop Canada	ISO 910
L-valine	Reagent	BioShop Canada	VAL 201
L-lysine	Reagent	BioShop Canada	LYS 101
L-phenylalanine	Reagent	BioShop Canada	PHA 302
L-glutamic acid	Reagent	BioShop Canada	GLU 202
L-threonine	Reagent	BioShop Canada	THR002
L-leucine	Reagent	BioShop Canada	LEU 222