Dissekering av Saccharomyces cerevisiae ASCI

Summary

Mikromanipulation av jästceller behövs för meiotiska genetisk analys eller för att välja diploida zygotes. Dessa micromanipulations utförs med microneedle en dissektion mikroskop. Den microneedle används för att flytta celler och styrs av en mikromanipulator som finns med olika grader av automatisering.

Abstract

Jäst är en mycket lätthanterlig modell system som används för att studera många olika cellulära processer. Den gemensamma laboratoriet stammen

Protocol

Konstruktion av diploida stammar
Protokoll för produktion av diploider vid parning

1. Den ursprungliga stammar bör strykas på YPD eller selektivt medium om det är nödvändigt, för att producera enstaka kolonier. De två haploida stammar bör vara av motsatt parning typ (dvs. Mata och MATα).
2. Använd en steril ympning slinga plocka en liten del av en koloni från en av de två haploida stammar. På en ny YPD tallrik strimma loopen en gång i en rak linje tvärs över plattan. Markera riktning strimma med en pil på undersidan av plattan.
3. Upprepa detta för den andra påfrestningar på samma YPD platta. Den här gången strimma kolonin vinkelrätt mot den första, passerar den första strimma med den andra. Markera riktning den andra strimma och notera det område där den andra strimma korsar den första. Detta område kommer att vara där diploider kommer att produceras.
4. Inkubera YPD plattan vid 30 ° C över natten.
5. Replica plattan i YPD plattan på selektiva medier som selektivt tillåter tillväxt av det nybildade diploider.
6. Välj en koloni om möjligt, eller en liten del av den diploida strimma och strimma på samma selektivt substrat för att generera enstaka kolonier.

Sporulering och rötning av ASCI
Protokoll

1. Välj enstaka kolonier från plattan ovan och göra små (1 cm x 1cm) fläckar på sporulering (SPO) plattor och inkubera vid 30 ° C i 3-7 dagar för att sporulate.
2. Sporulering kan kontrolleras genom att titta på celler från varje lapp i ett ljusmikroskop. Placera celler på ett objektsglas om 5-10 l vatten, lägg på ett täckglas ovanpå droppen, och leta efter förekomst av ASCI. Om ASCI inte är lätt att hitta sedan lägga tillbaka i inkubatorn.
3. Om det är effektivt sporulering i en av de patchar, förbereda en steril 15 ml koniska rör med 100μL av tetrad juice.
4. Plocka celler upp från denna sporulering lapp med en steril 3mm inokulering loop (celler bör täcka ¼ av en slinga) och placera i tetrad juice. Snurra försiktigt slingan så att cellerna faller av slingan och blanda med lösningen.
5. Lämna i tetrad juice (innehåller zymolyase) för 4-10mins (beroende på koncentration och aktivitet zymolyase och stammen själv). Detta möjliggör nedbrytning av cellväggen som omger ascospores.
6. Markera toppen och botten av inokulat regionen på ett YPD tallrik.
7. Valfritt. Reaktionen kan stoppas genom tillsats av 1 mL iskall sterila dH ₂ O. Låt cellerna att nöja 5mins. Ta bort 1 mL av supernatanten blandas sedan lätt hand och hålla på is.
8. Ta 5μL av smält celler från steg 5 och försiktigt placera droppar i en linje i inokulat regionen före-märkta YPD plåt.
9. Använd en steril 3mm ympning slinga för att mycket försiktigt sprida droppar 1-3 gånger i en linje medan knappt att ta kontakt med agar.
10. Låt vätskan att absorbera in i agar (Om steg 7 utelämnas detta när nedbrytning av den yttre cellväggen kommer att minskas eller stopp). Fortsätt till dissekering mikroskop.

Dissekering av ASCI
Protokoll

Observera att följande protokoll beskrivs för en Singer MSM System 200 mikromanipulation mikroskop. Detta protokoll kan följas med smärre ändringar om du använder en manuell mikromanipulator som ett Zeiss mikromanipulator MR.

1. Fokusera på en region i plattan där hälften av fältet innehåller celler och hälften är tom. Sakta få nålen i fokus så att den vidrör den tomma delen av fältet. Detta garanterar att nålen inte innehåller celler från en tidigare användning. Kontakt mellan nålen och agar ses som ett mörkt svart cirkel som sakta kommer i fokus.
2. Gå till matrisen vid position A1 och göra en markering av piercing agarn igen. Detta för att bidra till att avgöra riktningen på plattan om det tas bort mikroskop innan den är slutförd.
3. Växla till sökläge. Leta upp en ASCI. Helst väljer ASCI som är i områden där cellerna är väl utspridda. Undvik områden med cell kluster. De fyra ascospores från en ASCI fortfarande bör knytas till varandra. Två ascospores kan vara något större än de andra två. Undvik att plocka ASCI där en ascospore är lös och inte ansluten till resten av ascospores.
4. Plocka upp en ascus med nålen. Sakta föra nålen upp till plattan. När skuggan av microneedle ses, rad upp detta med ascus som ska plockas. Återigen tillvägagångssätt nålen tills den svarta konturen av en cirkel (spetsen på nålen) ses. Peka på tetrad med denna cirkel och sedan snabbt dra nålen bort. Se till att alla fyra ascospores från en ascus har anslutit sig till nål och att inga ytterligare celler samlades på microneedle som inte är en del av denna ascus.
5. Dra microneedle långt bort från plattan och gå till matrisen (för första ascus, gå tillposition A1). Ta del av varje plats där en ascus flyttas. Placera ascus ner genom att vidröra plattan med microneedle och dra bort tills alla fyra ascospores lossna microneedle. Gentle avlyssning av nålen arm eller den plattform som håller YPD plattan är ofta användbart i detta steg.
6. Upprepa steg 3-5 och plats ASCI ner på varandra följande positioner på matrisen tills önskat antal ASCI har valts.
7. Gå tillbaka till varje ascus och bryta de fyra cellerna sönder av retas med nålen, knacka på plattformen försiktigt eller en kombination av båda. Plocka upp cellerna lämnar en kvar på en ny position i matrisen tills varje ascospore i varje ascus separeras i rader om fyra.
8. Placera YPD plattan i en inkubator vid 30 ° C i flera dagar för att observera tillväxt mönster.
9. Replica plattan de dissekerade cellerna att selektivt medium om det behövs.

Flytt av Zygotes
Protokoll

1. Streak ut två haploida stammar med motsatta parningstyper på lämpligt medium för att få enstaka kolonier.
2. Parar dessa två stammar som beskrivs ovan och låt den växa från 4 till 6 timmar (eller över natten om det behövs).
3. Kontrollera om zygotes under ett ljusmikroskop. Zygotes visas som hantel-formade celler med eller utan en knopp.
4. Plocka celler upp med en 3 mm inokulering loop (celler bör täcka ¼ av en slinga) och lägg försiktigt i 100μL sterilt dH ₂ O.
5. Markera toppen och botten av inokulat regionen på ett YPD tallrik.
6. Ta 5μL och försiktigt placera droppar i en linje i inokulat regionen före-märkta YPD plåt.
7. Använd en 3mm ympning slinga för att sprida droppar i en rad mycket försiktigt medan knappt att ta kontakt med agar.
8. Låt vätskan att absorbera in i agar. Fortsätt till dissekering mikroskop.
9. Fokusera på en region i plattan där hälften av fältet innehåller celler och hälften är tom. Sakta få nålen i fokus så att den vidrör den tomma delen av fältet. Detta kommer att säkerställa att nålen inte innehåller celler från en tidigare användning. Kontakt mellan nålen och agar ses som ett mörkt svart cirkel som sakta kommer i fokus.
10. Gå till matrisen vid position A1 och göra en markering av piercing agarn igen. Detta för att bidra till att avgöra riktningen på plattan om det tas bort mikroskop innan den är slutförd.
11. Växla till sökläge. Hitta en zygot.
12. Plocka upp en zygot med nålen.
13. Placera zygotes individuellt på matrisen.
14. Låt zygotes att växa i flera dagar.
15. Replica plattan på zygotes på lämpliga selektivt medium.

Representativa resultat

Figur 1: parning av två haploida stammar av motsatt parningstyper genererar en diploida stammen.

Figur 2: (a) En YPD tallrik med thre resultatet av en parning mellan en temperaturkänslig stam (med en leu2 auxotrophy) och en vild typ stam (LEU2). Smält celler sprids i inokulatet regionen till vänster där tjocka tillväxten mellan de två svarta linjerna syns. ASCI som har dissekerat växa jämnt fördelade i matrisen till höger. (B) plattan i (A) speglades på ett SD-Leucin avhopp plåt. Observera 02:02 tillväxten för LEU2 markör som visar en validerad ascospore var dissekeras. (C) plattan i (A) speglades på en YPD plattan och inkuberas vid 37 ° C. Observera 02:02 tillväxt som ytterligare bekräftar att en ascospore var dissekeras.

Discussion

Jäst dissektion är ett användbart verktyg för att välja nya stammar med önskade markörer. Vid bestämning av teoretiska tillväxtmönster fyra ascospores är det viktigt att titta på genotypen för den vegetativa cellen. Om en plasmid är närvarande, måste man veta om det är singel, låg eller hög kopia som detta kommer att påverka vilka ascospore (s) får plasmiden och kommer att påverka förutsägelser och slutsatser om de påfrestningar som manipuleras.

Vissa stammar kan sporulate bättre än andra producerar många ascospores på kort tid. Andra stammar kan bara ge en låg andel av ascospores. Detta har ingen inverkan på experimentet så länge tillräckligt sant ASCI kan väljas. Dessutom stammar reagerar annorlunda under cellvägg matsmältningen och det är nödvändigt att empiriskt justera inkubationstiden i tetrad juice.

När du väljer celler med den önskade markörer, bör man bara välja de som kommer från en ASCI där tillväxtmönster av alla ascospores motsvara den teoretiska tillväxtmönster och från en dissektion, där den stora majoriteten av alla ascospores leda till den förväntade tillväxten mönster.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Singer MSM System 200	Microscope	Singer Instruments	NA
D-sorbitol	Reagent	BioShop Canada	SOR508
Tris	Reagent	BioShop Canada	TRS001
Zymolyase 100T	Reagent	Seikagaku Corporation	120493
Yeast extract	Reagent	BioShop Canada	YEX401
Peptone	Reagent	BioShop Canada	PEP 403
D-glucose	Reagent	BioShop Canada	GLU501
Yeast nitrogen base	Reagent	BioShop Canada	YNB406
Bio-tryptone	Reagent	BioShop Canada	TRP402
Sodium chloride	Reagent	BioShop Canada	SOD002
Potassium acetate	Reagent	BioShop Canada	POA 301
Agar	Reagent	BioShop Canada	AGR003
Adenine sulfate	Reagent	BioShop Canada	ADS201
L-uracil	Reagent	BioShop Canada	URA 241
L-tryptophan	Reagent	BioShop Canada	TRP 100
L-histidine	Reagent	BioShop Canada	HIS 200
L-arginine	Reagent	Amresco	0877-100G
L-methionine	Reagent	BioShop Canada	MET 222
L-tyrosine	Reagent	BioShop Canada	TYR 333
L-isoleucine	Reagent	BioShop Canada	ISO 910
L-valine	Reagent	BioShop Canada	VAL 201
L-lysine	Reagent	BioShop Canada	LYS 101
L-phenylalanine	Reagent	BioShop Canada	PHA 302
L-glutamic acid	Reagent	BioShop Canada	GLU 202
L-threonine	Reagent	BioShop Canada	THR002
L-leucine	Reagent	BioShop Canada	LEU 222