Summary
وهناك حاجة المجهرية من خلايا الخميرة عن التحليل الوراثي لتحديد الانتصافي أو بيضات ملقحة مضاعفا. وتنفذ هذه micromanipulations خارج باستخدام المجهر microneedle من تشريح. يستخدم لنقل microneedle الخلايا ، ويتم التحكم بها micromanipulator التي تتوفر مع درجات مختلفة من التشغيل الآلي.
Abstract
الخميرة هي نظام نموذجي الانقياد إلى حد كبير أن تستخدم لدراسة العديد من العمليات الخلوية المختلفة. سلالة المختبرية المشتركة
Protocol
بناء سلالات ضعفاني
بروتوكول للانتاج عن طريق التزاوج diploids
- ينبغي ضرب سلالات المبدئي على YPD المتوسطة ، أو انتقائية إذا لزم الأمر ، لإنتاج مستعمرات واحد. ينبغي أن يكون فرداني سلالتين من نوع التزاوج المعاكس (أي. MATA وMATα).
- استخدام حلقة تلقيح معقمة اختيار جزء صغير من مستعمرة من واحدة من سلالتين فرداني. على خط جديد لوحة YPD الحلقة مرة واحدة في خط مستقيم عبر لوحة. علامة اتجاه خط مع سهم على الجزء السفلي من اللوحة.
- لتكرار هذه السلالة الثانية على لوحة للYPD نفسه. هذه المرة خط عمودي لأول مستعمرة ، عبور خط الأولى مع الثانية. علامة اتجاه خط المذكرة الثانية والمنطقة حيث يعبر خط second الأولى. وسوف تكون هذه المنطقة حيث سيتم إنتاج diploids.
- احتضان لوحة YPD عند 30 درجة مئوية خلال الليل.
- طبق الاصل لوحة لوحة على وسائط YPD انتقائية تسمح انتقائيا نمو diploids التي تشكلت حديثا.
- اختيار مستعمرة واحدة إذا أمكن ذلك ، أو جزء صغير من ضعفاني متتالية ومتواصلة على المتوسط وانتقائية لتوليد نفس المستعمرات واحد.
تبوغ وهضم زقاق
بروتوكول
- اختيار واحد من المستعمرات لوحة أعلاه ، وجعل الصغيرة (خ 1cm 1cm) بقع على لوحات (SPO) تبوغ واحتضان على 30 درجة مئوية لمدة 3-7 أيام لsporulate.
- يمكن التحقق تبوغ من خلال النظر في الخلايا من كل التصحيح تحت المجهر الخفيفة. مكان الخلايا على شريحة مجهر ميكرولتر في 50-10 من المياه ، ووضع على رأس ساترة الحبرية ، ونتطلع لوجود زقاق. إذا لم يتم العثور على زقاق بسهولة ثم وضع مرة أخرى في الحاضنة.
- إذا كان هناك تبوغ فعالة في واحدة من البقع ، ويعد أنبوب مخروطي 15mL العقيمة مع 100μL من عصير الرباعيات.
- اختيار الخلايا ارتفاعا من هذا التصحيح تبوغ مع حلقة التلقيح 3mm العقيمة (خلايا ينبغي أن تغطي ربع حلقة) ومكانته في عصير الرباعيات. دوامة الحلقة برفق للسماح للخلايا لتسقط في حلقة والاختلاط مع الحل.
- إجازة في عصير الرباعيات (التي تحتوي على zymolyase) ل10mins - 4 (اعتمادا على التركيز والنشاط وzymolyase السلالة نفسها) ، وهذا يسمح للهضم جدار الخلية المحيطة ascospores.
- بمناسبة القمة والقاع في المنطقة على طبق من ذهب لقيحة YPD.
- اختيارية. يمكن إيقاف التفاعل بإضافة 1mL من البرد الجليدي العقيمة O. 2 درهم تسمح هذه الخلايا إلى تسوية ل5mins. إزالة 1mL من المزيج ثم طاف طفيفة من جهة ، والحفاظ على الجليد.
- تأخذ الخلايا 5μL هضمها من الخطوة (5) وقطرات بلطف مكان في خط في المنطقة من لوحة قيحة قبل YPD ملحوظ.
- استخدام التلقيح حلقة عقيمة 3mm ل بلطف شديد انتشار قطرات 1-3 مرات في حين جعل بالكاد خط اتصال مع آغار.
- السماح لامتصاص السائل في آغار (إذا تم حذف الخطوة 7 ، وهذا هو متى سيتم تخفيض هضم جدار الخلية الخارجي أو إيقاف). انتقل إلى مجهر تشريح.
تشريح زقاق
بروتوكول
علما بأن يوصف بروتوكول التالية لنظام سوق مسقط المجهر المجهرية سنجر 200. يمكن أن يتبع هذا البروتوكول مع تعديلات طفيفة في حالة استخدام دليل micromanipulator مثل MR micromanipulator زايس.
- التركيز على منطقة من لوحة حيث نصف الحقل يحتوي على الخلايا ونصف فارغ. جلب ببطء الإبرة في التركيز بحيث تلامس منطقة خالية من الحقل. وهذا تأكد من أن الإبرة لا تحتوي على خلايا من استخدام السابقة. ويعتبر الاتصال بين الإبرة وأغار على النحو دائرة سوداء مظلمة التي تأتي ببطء إلى التركيز.
- انتقل إلى مصفوفة في A1 الموقف وجعل علامة بواسطة ثقب آغار مرة أخرى. هذا هو للمساعدة في تحديد اتجاه لوحة إذا أخذ تشغيله المجهر قبل إتمامه.
- التبديل إلى وضع البحث. تحديد موقع زقاق. يفضل اختيار زقاق التي هي في المناطق التي تنتشر بشكل جيد خارج الخلايا. تجنب المناطق مع كتل الخلية. وينبغي أن لا يزال ascospores four من زقاق ضمها الى بعضها البعض. يجوز لاثنين من ascospores يكون أكبر قليلا من الأخريين. تجنب التقاط زقاق واحد حيث بوغ زقي واهية وغير مرتبطة بقية ascospores.
- التقاط أي زق مع الإبرة. جلب ببطء الإبرة يصل إلى اللوحة. عندما ينظر ظل microneedle ، سطر ويمكن الحصول على هذا الأمر مع زق. مرة أخرى نقترب من الإبرة حتى يتم النظر في مخطط دائرة سوداء (غيض من الإبرة). تلمس الرباعيات مع هذه الدائرة ومن ثم سحب الإبرة بسرعة بعيدا. تأكد من أن جميع ascospores four من زق انضمت إلى الإبرة والتي تم جمعها وجود خلايا إضافية عن microneedle التي لا تشكل جزءا من هذا زق.
- سحب microneedle بعيدا عن لوحة وانتقل إلى مصفوفة (للاطلاع على زق الأولى ، انتقل إلىموقف A1). يحيط علما كل موقف حيث يتم نقل an زق. ضع زق بنسبة لمس لوحة مع microneedle وتبتعد حتى عن ascospores الاربعة هم خارج microneedle. التنصت على لطيف للذراع إبرة أو منصة عقد لوحة YPD غالبا ما يكون من المفيد في هذه الخطوة.
- كرر الخطوات من 3-5 ومكان في اسفل زقاق مواقف متتالية في مصفوفة حتى تم القبض على العدد المرغوب فيه من زقاق.
- أعود إلى كل زق وكسر الخلايا four إربا إغاظة مع الإبرة ، والتنصت على منصة بلطف أو مزيج من الاثنين معا. تلتقط الخلايا في ترك واحدة وراء موقف جديد في مصفوفة حتى يتم فصل كل بوغ زقي في كل زق في الصفوف الأربعة.
- مكان لوحة YPD في حاضنة عند 30 درجة مئوية لعدة أيام لمراقبة نمط النمو.
- طبق الاصل لوحة الخلايا تشريح والمتوسطة الانتقائي إذا لزم الأمر.
نقل بيضات ملقحة
بروتوكول
- مسحة من سلالتين فرداني مع أنواع التزاوج على عكس المتوسطة المناسبة للحصول على المستعمرات واحد.
- لم هذه سلالتين على النحو الموصوف أعلاه ، والسماح لينمو من 4 الى 6 ساعات (أو بين عشية وضحاها إذا لزم الأمر).
- تحقق من وجود بيضات ملقحة تحت المجهر الخفيفة. بيضات ملقحة سوف تظهر على شكل خلايا دمبل سواء مع أو بدون برعم.
- اختيار الخلايا مع حلقة التلقيح 3mm (خلايا ينبغي أن تغطي ربع من الحلقة) ، وبلطف في مكان معقم 100μL من O. 2 درهم
- بمناسبة القمة والقاع في المنطقة على طبق من ذهب لقيحة YPD.
- تأخذ 5μL وبلطف مكان قطرات في خط في المنطقة من لوحة قيحة قبل YPD ملحوظ.
- استخدام حلقة التلقيح 3mm ل انتشار قطرات في خط بلطف جدا بينما بالكاد جعل اتصال مع آغار.
- السماح لامتصاص السائل في أجار. انتقل إلى مجهر تشريح.
- التركيز على منطقة من لوحة حيث نصف الحقل يحتوي على الخلايا ونصف فارغ. جلب ببطء الإبرة في التركيز بحيث تلامس منطقة خالية من الحقل. وهذا تأكد من أن الإبرة لا تحتوي على خلايا من استخدام السابقة. ويعتبر الاتصال بين الإبرة وأغار على النحو دائرة سوداء مظلمة التي تأتي ببطء إلى التركيز.
- انتقل إلى مصفوفة في A1 الموقف وجعل علامة بواسطة ثقب آغار مرة أخرى. هذا هو للمساعدة في تحديد اتجاه لوحة إذا أخذ تشغيله المجهر قبل إتمامه.
- التبديل إلى وضع البحث. تحديد موقع الزيجوت.
- يلتقط اقحة مع الإبرة.
- مكان بيضات ملقحة بشكل فردي على المصفوفة.
- تسمح بيضات ملقحة تنمو لعدة أيام.
- طبق الاصل للوحة بيضات ملقحة والمتوسطة على انتقائية مناسبة.
ممثل النتائج
الشكل 1 : التزاوج من سلالتين فرداني أنواع التزاوج العكس يولد ضغطا مضاعفا.
الشكل 2 : (أ) لوحة YPD مع نتائج ثلاث ، من التزاوج بين سلالة حساسة درجة الحرارة (مع auxotrophy leu2) وسلالة ونوع البرية (LEU2). وتنتشر الخلايا هضمها في المنطقة قيحة على اليسار حيث يعتبر النمو الكثيف بين الخطين السود. تنمو متباعدة بالتساوي زقاق التي تم تشريح في المصفوفة على اليمين. (ب) وتكرر في لوحة (أ) على لوحة التسرب SD - يسين. لاحظ نمو 02:02 لعلامة تشير LEU2 كان تشريح a بوغ زقي التحقق من صحتها. (C) وتكرر في لوحة (أ) على لوحة YPD والمحتضنة في 37 درجة مئوية. لاحظ نمو 02:02 من صحة كذلك أنه تم تشريح an بوغ زقي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تشريح الخميرة هي أداة مفيدة لتحديد سلالات جديدة مع العلامات المطلوبة. عند تحديد نمط النمو النظرية أربعة ascospores من المهم أن ننظر إلى التركيب الوراثي للخلية النباتية. إذا البلازميد هو الحاضر ، يجب على المرء أن يعرف إذا كانت نسخة واحدة ، وانخفاض أو ارتفاع لأن هذا سيؤثر التي بوغ زقي (ق) تحصل على البلازميد وستؤثر على توقعات واستنتاجات بشأن الضغوط التي يجري التلاعب بها.
ويمكن للسلالات معينة sporulate أفضل من غيرها المنتجة ascospores كثيرة في فترة قصيرة من الزمن. سلالات أخرى قد تسفر سوى نسبة ضئيلة من ascospores. هذا لم يكن له أي تأثير على التجربة طالما فيه الكفاية يمكن ان يتم اختيار زقاق صحيحا. وعلاوة على ذلك ، وسلالات مختلفة تستجيب أثناء الهضم جدار الخلية ومن الضروري لضبط تجريبيا فترة حضانة في عصير الرباعيات.
عند اختيار الخلايا التي تحتوي على علامات المطلوب ، وينبغي للمرء أن يختار فقط تلك التي تأتي من زقاق حيث نمط النمو لجميع ascospores تتوافق مع نمط النمو النظرية والتشريح من حيث الغالبية العظمى من جميع ascospores تؤدي إلى نمط النمو المتوقع.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما تكشف.
Acknowledgments
ويتم تمويل عمل في مختبر البلاغ من قبل المعاهد الكندية لأبحاث الصحة ، والمؤسسة الكندية للإبداع ، والعلوم الطبيعية والهندسة مجلس البحوث وجامعة كونكورديا.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Singer MSM System 200 | Microscope | Singer Instruments | NA | |
| D-sorbitol | Reagent | BioShop Canada | SOR508 | |
| Tris | Reagent | BioShop Canada | TRS001 | |
| Zymolyase 100T | Reagent | Seikagaku Corporation | 120493 | |
| Yeast extract | Reagent | BioShop Canada | YEX401 | |
| Peptone | Reagent | BioShop Canada | PEP 403 | |
| D-glucose | Reagent | BioShop Canada | GLU501 | |
| Yeast nitrogen base | Reagent | BioShop Canada | YNB406 | |
| Bio-tryptone | Reagent | BioShop Canada | TRP402 | |
| Sodium chloride | Reagent | BioShop Canada | SOD002 | |
| Potassium acetate | Reagent | BioShop Canada | POA 301 | |
| Agar | Reagent | BioShop Canada | AGR003 | |
| Adenine sulfate | Reagent | BioShop Canada | ADS201 | |
| L-uracil | Reagent | BioShop Canada | URA 241 | |
| L-tryptophan | Reagent | BioShop Canada | TRP 100 | |
| L-histidine | Reagent | BioShop Canada | HIS 200 | |
| L-arginine | Reagent | Amresco | 0877-100G | |
| L-methionine | Reagent | BioShop Canada | MET 222 | |
| L-tyrosine | Reagent | BioShop Canada | TYR 333 | |
| L-isoleucine | Reagent | BioShop Canada | ISO 910 | |
| L-valine | Reagent | BioShop Canada | VAL 201 | |
| L-lysine | Reagent | BioShop Canada | LYS 101 | |
| L-phenylalanine | Reagent | BioShop Canada | PHA 302 | |
| L-glutamic acid | Reagent | BioShop Canada | GLU 202 | |
| L-threonine | Reagent | BioShop Canada | THR002 | |
| L-leucine | Reagent | BioShop Canada | LEU 222 |
References
- Sherman, F., Hicks, J. Micromanipulation and Dissection of Asci. Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology. Guthrie, C., Fink, G. R. , Academic Press. San Diego. 21-37 (1991).
