Summary
खमीर कोशिकाओं के Micromanipulation meiotic आनुवंशिक विश्लेषण या द्विगुणित zygotes का चयन के लिए की जरूरत है. ये micromanipulations बाहर किया जाता है एक विच्छेदन खुर्दबीन के microneedle का उपयोग. microneedle कोशिकाओं को स्थानांतरित करने के लिए प्रयोग किया जाता है और एक micromanipulator जो स्वचालन के विभिन्न डिग्री के साथ उपलब्ध हैं द्वारा नियंत्रित है.
Abstract
खमीर एक अत्यंत विनयशील मॉडल प्रणाली है कि कई अलग अलग सेलुलर प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए प्रयोग किया जाता है. आम प्रयोगशाला तनाव
Protocol
द्विगुणित उपभेदों का निर्माण
संभोग द्वारा diploids के उत्पादन के लिए प्रोटोकॉल
- प्रारंभिक उपभेदों YPD, या चयनात्मक मध्यम पर बाहर मारा जाना चाहिए, यदि आवश्यक हो एकल कालोनियों का उत्पादन करने के लिए. दो अगुणित उपभेदों विपरीत संभोग प्रकार (ie. माता और MATα) का होना चाहिए.
- एक बाँझ टीका पाश का प्रयोग दो अगुणित उपभेदों के एक से एक कॉलोनी की एक छोटा सा हिस्सा लेने. एक नया YPD थाली लकीर पाश एक बार थाली भर में एक सीधी रेखा में. मार्क थाली के तल पर एक तीर के साथ लकीर की दिशा.
- एक ही YPD प्लेट पर दूसरे तनाव के लिए इस दोहराएँ. इस बार पहले कॉलोनी सीधा लकीर, दूसरे के साथ पहली लकीर पार. दूसरी लकीर के दिशा मार्क और क्षेत्र है जहां दूसरी लकीर पहली पार ध्यान दें. इस क्षेत्र में जहां diploids उत्पादन किया जाएगा किया जाएगा.
- 30 ° रातोंरात सी YPD की थाली सेते हैं.
- प्रतिकृति प्लेट चयनात्मक मीडिया पर YPD थाली है कि चुनिंदा नवगठित diploids के विकास की अनुमति देगा.
- एकल कालोनियों उत्पन्न एक ही चयनात्मक मध्यम पर यदि संभव हो तो एक कॉलोनी, या द्विगुणित लकीर और लकीर के एक छोटे से हिस्से उठाओ.
Sporulation और एएससीआई के पाचन
प्रोटोकॉल
- ऊपर थाली से एकल कालोनियों उठाओ और छोटे (1cm 1cm) x sporulation प्लेटें (एसपीओ) पर पैच और 3-7 दिनों के लिए sporulate लिए 30 ° C पर सेते हैं.
- Sporulation हर पैच से एक प्रकाश खुर्दबीन के नीचे कोशिकाओं को देख के द्वारा जाँच की जा सकती है. पानी की 5-10 μl में एक खुर्दबीन स्लाइड पर प्लेस कोशिकाओं, छोटी बूंद के शीर्ष पर एक coverslip जगह है, और एएससीआई की उपस्थिति के लिए देखो. यदि एएससीआई आसानी से नहीं पाए जाते हैं तो इनक्यूबेटर में वापस डाल दिया.
- अगर वहाँ एक पैच में प्रभावी sporulation है, tetrad रस के 100μL के साथ एक बाँझ 15ml शंक्वाकार ट्यूब तैयार करते हैं.
- कोशिकाओं एक बाँझ 3mm टीका पाश (कोशिकाओं पाश की ¼ को कवर किया जाना चाहिए) और tetrad रस में जगह के साथ इस sporulation पैच से उठाओ. धीरे कोशिकाओं से गिर करने के लिए पाश और समाधान के साथ मिश्रण की अनुमति पाश ज़ुल्फ़.
- 4 - 10mins (zymolyase और तनाव ही की एकाग्रता और गतिविधि पर निर्भर करता है) के लिए tetrad रस (zymolyase युक्त) में छोड़ दें यह कोशिका दीवार आसपास ascospores के पाचन के लिए अनुमति देता है.
- ऊपर और एक YPD प्लेट पर inoculum क्षेत्र के नीचे चिह्नित.
- वैकल्पिक. रिएक्शन बर्फ ठंड बाँझ DH 2 ओ के 1ml जोड़कर रोका जा सकता है है कोशिकाओं 5mins के लिए व्यवस्थित करने के लिए अनुमति दें. सतह पर तैरनेवाला से निकालें 1ml तो हाथ से हल्के मिश्रण और बर्फ पर रख.
- चरण 5 से पचा कोशिकाओं के 5μL ले लो और धीरे जगह पूर्व चिह्नित YPD थाली के inoculum क्षेत्र में एक पंक्ति में चला जाता है.
- एक बाँझ 3mm टीका पाश का उपयोग बहुत धीरे से एक लाइन में बूँदें 1-3 बार फैल जबकि बमुश्किल अगर साथ संपर्क बनाने.
- अगर में अवशोषित (यदि चरण 7 छोड़ा जाता है, यह है जब बाहरी सेल की दीवार के पाचन या कम हो जाएगा रोक) के लिए तरल की अनुमति दें. विच्छेदन खुर्दबीन के लिए आगे बढ़ें.
एएससीआई के विच्छेदन
प्रोटोकॉल
ध्यान दें कि एक सिंगर एमएसएम सिस्टम 200 micromanipulation खुर्दबीन के लिए निम्नलिखित प्रोटोकॉल में वर्णित है. इस प्रोटोकॉल जैसे एक Zeiss micromanipulator एमआर पुस्तिका micromanipulator का उपयोग कर यदि मामूली संशोधनों के साथ पीछा किया जा सकता है.
- जहां क्षेत्र के आधे कोशिकाओं होता है और आधा खाली है थाली के एक क्षेत्र पर ध्यान दें. धीरे धीरे ऐसी है कि यह क्षेत्र के खाली क्षेत्र छू ध्यान में सुई ले आओ. इससे यह सुनिश्चित होगा कि सुई पिछले एक प्रयोग से कोशिकाओं को शामिल नहीं करता है. सुई और अगर बीच संपर्क है कि धीरे धीरे ध्यान में आता है एक अंधेरे काले वृत्त के रूप में देखा जाता है.
- स्थिति A1 का मैट्रिक्स के लिए जाओ और अगर फिर भेदी द्वारा एक निशान बना. यह करने में मदद के लिए थाली के उन्मुखीकरण का निर्धारण अगर इसे हटा लिया है, पूरा होने से पहले खुर्दबीन की है.
- खोज मोड पर स्विच करें. एक एएससीआई पता लगाएँ. अधिमानतः जो क्षेत्रों में जहां कोशिकाओं को अच्छी तरह से बाहर फैल रहे हैं में हैं एएससीआई लिए चुनते हैं. सेल समूहों के साथ क्षेत्रों से बचें. एक एएससीआई से चार ascospores अभी भी एक दूसरे से संलग्न होना चाहिए. दो ascospores थोड़ा अन्य दो से अधिक बड़ा हो सकता है. एएससीआई जहां एक ascospore ढीला और ascospores के आराम करने के लिए जुड़ा हुआ नहीं है खोदने से बचें.
- सुई के साथ एक ascus उठाओ. धीरे धीरे थाली करने के लिए सुई ऊपर लाने के. जब microneedle की छाया में देखा जाता है लाइन, ascus के साथ इस उठाया जा करने के लिए. फिर सुई दृष्टिकोण जब तक एक चक्र (सुई की नोक) की काली रूपरेखा देखा जाता है. इस चक्र के साथ tetrad टच और फिर जल्दी से सुई दूर खींच. यकीन है कि एक ascus से सभी चार ascospores सुई का पालन किया है और कोई अतिरिक्त कोशिकाओं microneedle है कि इस ascus का हिस्सा नहीं हैं पर इकट्ठे हुए थे.
- Microneedle थाली से दूर खींचो और मैट्रिक्स (पहली ascus के लिए, जाने के जाओस्थिति A1). प्रत्येक स्थान है जहाँ एक ascus जगह बदली है का नोट ले लो. Ascus microneedle के साथ थाली छू और दूर खींच जब तक सभी चार ascospores बंद microneedle आ द्वारा नीचे रखें. सुई हाथ या YPD थाली पकड़े मंच की कोमल दोहन अक्सर इस कदम पर भी उपयोगी है.
- 3-5 कदम और मैट्रिक्स पर लगातार पदों पर एएससीआई जगह नीचे दोहराएँ जब तक एएससीआई की वांछित संख्या चुना गया है.
- प्रत्येक ascus के लिए वापस जाओ और चार कोशिकाओं सुई के साथ चिढ़ा धीरे मंच या दोनों के संयोजन का दोहन करके टूट. उठाओ पीछे मैट्रिक्स में एक नए स्थान पर जब तक प्रत्येक ascus में प्रत्येक ascospore चार की पंक्तियों में अलग है छोड़ने कोशिकाओं.
- 30 ° कई दिनों के लिए सी वृद्धि पैटर्न का पालन एक इनक्यूबेटर में YPD थाली प्लेस.
- प्रतिकृति प्लेट यदि आवश्यक हो चयनात्मक माध्यम से dissected कोशिकाओं.
Zygotes के स्थानांतरण
प्रोटोकॉल
- एकल कालोनियों प्राप्त उपयुक्त माध्यम पर विपरीत संभोग प्रकार के साथ दो अगुणित उपभेदों बाहर स्ट्रीक.
- मेट इन दो उपभेदों के रूप में ऊपर वर्णित है और 4 से 6 घंटे (या रातोंरात यदि आवश्यक हो तो) से बढ़ने की अनुमति.
- एक रोशनी खुर्दबीन के तहत zygotes के लिए जाँच करें. Zygotes dumbbell के आकार कोशिकाओं के साथ या बिना एक कली के रूप में दिखाई देगा.
- कोशिकाओं एक 3mm टीका पाश (कोशिकाओं पाश की ¼ को कवर किया जाना चाहिए) के साथ उठाओ और धीरे बाँझ DH 2 ओ के 100μL में जगह
- ऊपर और एक YPD प्लेट पर inoculum क्षेत्र के नीचे चिह्नित.
- 5μL ले लो और धीरे जगह पूर्व चिह्नित YPD थाली के inoculum क्षेत्र में एक पंक्ति में चला जाता है.
- एक 3mm टीका पाश का उपयोग करने के लिए एक पंक्ति में बूँदें बहुत धीरे से फैल जबकि बमुश्किल अगर साथ संपर्क बनाने के लिए.
- तरल अगर में अवशोषित करने की अनुमति दें. विच्छेदन खुर्दबीन के लिए आगे बढ़ें.
- जहां क्षेत्र के आधे कोशिकाओं होता है और आधा खाली है थाली के एक क्षेत्र पर ध्यान दें. धीरे धीरे ऐसी है कि यह क्षेत्र के खाली क्षेत्र छू ध्यान में सुई ले आओ. इससे यह सुनिश्चित होगा कि सुई पिछले एक प्रयोग से कोशिकाओं को शामिल नहीं करता है. सुई और अगर बीच संपर्क है कि धीरे धीरे ध्यान में आता है एक अंधेरे काले वृत्त के रूप में देखा जाता है.
- स्थिति A1 का मैट्रिक्स के लिए जाओ और अगर फिर भेदी द्वारा एक निशान बना. यह करने में मदद के लिए थाली के उन्मुखीकरण का निर्धारण अगर इसे हटा लिया है, पूरा होने से पहले खुर्दबीन की है.
- खोज मोड पर स्विच करें. युग्मनज पता लगाएँ.
- सुई के साथ एक युग्मनज उठाओ.
- जगह मैट्रिक्स पर व्यक्तिगत zygotes.
- Zygotes कई दिनों के लिए विकसित करने के लिए अनुमति दें.
- प्रतिकृति प्लेट उचित चयनात्मक मध्यम पर zygotes.
प्रतिनिधि परिणाम
चित्रा 1: विपरीत संभोग प्रकार के दो अगुणित उपभेदों के संभोग एक द्विगुणित तनाव उत्पन्न करता है.
चित्रा 2: (ए) एक तापमान संवेदनशील (एक leu2 auxotrophy) के साथ तनाव और एक जंगली प्रकार तनाव (LEU2) के बीच एक संभोग के thre परिणामों के साथ एक YPD थाली . पचा कोशिकाओं को छोड़ दिया, जहां दो काले लाइनों के बीच मोटी वृद्धि देखी है पर inoculum क्षेत्र में फैले हुए हैं. एएससीआई dissected किया गया है कि समान रूप से दाईं ओर मैट्रिक्स में दूरी बढ़ने. (बी) (ए) में प्लेट एक एसडी Leucine थाली ड्रॉप - आउट पर दोहराया गया था. LEU2 संकेत एक मान्य ascospore dissected था मार्कर के लिए विकास 02:02 नोट . (सी) (ए) में प्लेट एक YPD थाली पर दोहराया गया था और 37 डिग्री सेल्सियस पर incubated 02:02 वृद्धि है कि आगे पुष्टि है कि एक ascospore विच्छेदित किया गया था नोट.
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Discussion
खमीर विच्छेदन करने के लिए इच्छित मार्कर के साथ नए उपभेदों का चयन के लिए एक उपयोगी उपकरण है. जब चार ascospores के सैद्धांतिक विकास पैटर्न का निर्धारण यह महत्वपूर्ण है वनस्पति सेल के जीनोटाइप को देखो. यदि एक प्लाज्मिड मौजूद है, एक पता होना चाहिए अगर यह एक, कम या उच्च प्रतिलिपि के रूप में इस को प्रभावित करेगा जो ascospore (ओं) प्लाज्मिड प्राप्त करने के लिए और भविष्यवाणियों और चालाकी उपभेदों जा रहा है के बारे में निष्कर्ष को प्रभावित करेगा.
कुछ उपभेदों के रूप में समय की एक छोटी अवधि में कई ascospores उत्पादन दूसरों की तुलना में बेहतर sporulate कर सकते हैं. अन्य उपभेदों केवल ascospores की एक कम प्रतिशत उपज सकता है. यह प्रयोग लंबे समय के रूप में पर्याप्त सच एएससीआई के रूप में चयनित किया जा सकता है पर कोई असर नहीं है. इसके अलावा, उपभेदों कोशिका दीवार पाचन के दौरान अलग प्रतिक्रिया और यह empirically tetrad रस में ऊष्मायन समय को समायोजित करने के लिए आवश्यक है.
जब वांछित मार्कर के साथ कोशिकाओं का चयन, एक केवल उन है कि जहां सभी ascospores के विकास पैटर्न सैद्धांतिक विकास पैटर्न के अनुरूप एक एएससीआई से और एक विच्छेदन जहां सभी ascospores के विशाल बहुमत की उम्मीद विकास पैटर्न के लिए नेतृत्व से आते हैं चुनना चाहिए.
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Disclosures
लेखकों खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
लेखक की प्रयोगशाला में कार्य स्वास्थ्य अनुसंधान संस्थान कनाडा, अभिनव, प्राकृतिक विज्ञान और इंजीनियरिंग अनुसंधान परिषद और Concordia विश्वविद्यालय के लिए कनाडा फाउंडेशन द्वारा वित्त पोषित है.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Singer MSM System 200 | Microscope | Singer Instruments | NA | |
| D-sorbitol | Reagent | BioShop Canada | SOR508 | |
| Tris | Reagent | BioShop Canada | TRS001 | |
| Zymolyase 100T | Reagent | Seikagaku Corporation | 120493 | |
| Yeast extract | Reagent | BioShop Canada | YEX401 | |
| Peptone | Reagent | BioShop Canada | PEP 403 | |
| D-glucose | Reagent | BioShop Canada | GLU501 | |
| Yeast nitrogen base | Reagent | BioShop Canada | YNB406 | |
| Bio-tryptone | Reagent | BioShop Canada | TRP402 | |
| Sodium chloride | Reagent | BioShop Canada | SOD002 | |
| Potassium acetate | Reagent | BioShop Canada | POA 301 | |
| Agar | Reagent | BioShop Canada | AGR003 | |
| Adenine sulfate | Reagent | BioShop Canada | ADS201 | |
| L-uracil | Reagent | BioShop Canada | URA 241 | |
| L-tryptophan | Reagent | BioShop Canada | TRP 100 | |
| L-histidine | Reagent | BioShop Canada | HIS 200 | |
| L-arginine | Reagent | Amresco | 0877-100G | |
| L-methionine | Reagent | BioShop Canada | MET 222 | |
| L-tyrosine | Reagent | BioShop Canada | TYR 333 | |
| L-isoleucine | Reagent | BioShop Canada | ISO 910 | |
| L-valine | Reagent | BioShop Canada | VAL 201 | |
| L-lysine | Reagent | BioShop Canada | LYS 101 | |
| L-phenylalanine | Reagent | BioShop Canada | PHA 302 | |
| L-glutamic acid | Reagent | BioShop Canada | GLU 202 | |
| L-threonine | Reagent | BioShop Canada | THR002 | |
| L-leucine | Reagent | BioShop Canada | LEU 222 |
References
- Sherman, F., Hicks, J. Micromanipulation and Dissection of Asci. Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology. Guthrie, C., Fink, G. R. , Academic Press. San Diego. 21-37 (1991).
