の解剖サッカロマイセスセレビシエ ASCI

Summary

酵母細胞のマニピュレーションは、減数分裂の遺伝学的分析のために必要とされるか、二倍体の受精卵を選択する。これらmicromanipulationsは、解剖顕微鏡のマイクロニードルを用いて実施されています。マイクロニードルは、細胞を再配置するために使用され、自動化の様々な程度で使用可能なマニピュレータによって制御されます。

Abstract

酵母は、多くの異なる細胞プロセスを研究するために使用される非常に扱いやすいモデル系である。共通の実験室株

Protocol

二倍体菌株の構築
交配による二倍体の生産のためのプロトコル

1. 必要に応じて、単一のコロニーを生成する場合、最初の株はYPD、または選択培地上で三振してください。 two半数体株は、逆の交配型（すなわち、MATAとMATα）でなければならない。
2. 無菌接種ループを使用しては、2つの半数体株の一つから、コロニーの小さな部分を選択。新しいYPDプレートストリークループ一回プレート間の直線の上に。プレートの底部上に矢印の付いた線の方向をマーク。
3. 同じYPDプレート上の2番目の歪みのためにこれを繰り返します。最初にこの時間は、ストリークコロニーの垂直を、第二の最初の連勝を横切る。第二ストリークの方向をマークと第二ストリークが最初に交差するエリアに注意してください。二倍体が生成される場所をこのエリアにはなります。
4. 30℃で一晩YPDプレートをインキュベートする。
5. レプリカプレートを選択新しく形成された二倍体の成長を許可する選択培地上にYPDプレート。
6. 単一のコロニーを生成するために、同じ選択培地上に単一コロニー可能であれば、または二倍体の縞と縞の小さな部分を選択してください。

ASCIの胞子形成と消化
プロトコル

1. 上記のプレートから単一コロニーをピックアップし、（1センチメートルX 1CM）胞子形成（SPO）プレート上にパッチを小さくすると胞子形成に3-7日のために30℃でインキュベートする。
2. 胞子形成を光学顕微鏡下でそれぞれのパッチからの細胞を見てチェックすることができます。水の5〜10μlので顕微鏡のスライド上の場所細胞は、液滴の上にカバースリップを置き、ASCIの存在を探します。 ASCIが簡単に見つからない場合は、インキュベーターに戻す。
3. パッチのいずれかの効果的な胞子形成がある場合は、四分子​​ジュースの100μLを滅菌した15mlのコニカルチューブを準備する。
4. 滅菌3ミリメートル接種ループ（細胞がループの¼をカバーする必要があります）と四分子のジュースの代わりにこの胞子形成のパッチから細胞を採取する。優しくスワールループを細胞がソリューションとループとのミックスを落ちるようにする。
5. 4 - 10分（ザイモリアーゼと歪み自体の濃度や活性に応じて）のために四分子ジュース（ザイモリアーゼを含む）に残す。これは、子のう胞子を周囲の細胞壁の消化を可能にする。
6. YPDプレート上に接種領域の上部と下部をマーク。
7. 省略可能。反応物を氷冷滅菌のdH ₂ Oを1mLのを加えることによって停止することができます細胞は5minsのために解決することができます。手で軽く混ぜ、氷上で維持して上清から1mLのを削除します。
8. 手順5から消化細胞の5μLを取り、そっと場所は、事前にマークYPDプレートの接種領域の行にドロップします。
9. やっと寒天と接触しながら非常に軽くラインにドロップ1〜3回を広めるために滅菌3ミリメートル接種ループを使用してください。
10. 液体は寒天に吸収することを許可する（手順7が省略された場合、これは外側の細胞壁の消化が減少または停止される場合です）。解剖顕微鏡に進みます。

ASCIの解剖
プロトコル

以下のプロトコルはシンガーMSMシステム200マイクロマニピュレーションの顕微鏡で説明されていることに注意してください。このようなツァイスマイクロマニピュレータのMRとして手動マイクロマニピュレーターを使用している場合、このプロトコルは、若干の修正を追跡することができる。

1. フィールドの半分は細胞が含まれており、半分が空であるプレートの領域に焦点を当てる。ゆっくりとそれはフィールドの空の領域に触れるように焦点に針をもたらす。これは、針が前回使用時の細胞が含まれていないことが保証されます。針と寒天との間の接触は、ゆっくりと焦点に入ってくる暗い黒い丸として見られている。
2. 位置A1に行列に移動し、再び寒天を貫通することでマークを付けます。これは、それが完了する前に顕微鏡をオフに実行された場合、プレートの向きを判断することです。
3. 検索モードに切り替えます。 ASCIを見つけます。好ましくは、細胞が十分に広がっている地域にあるASCIを選択してください。細胞のクラスターを持つ領域を避けてください。 ASCIから4子のう胞子はまだお互いに接続する必要があります。二つの子のう胞子は、他の二つよりも若干大きくなることがあります。 one子嚢胞子が緩いと子のう胞子の残りの部分に接続されていないASCIを避けます。
4. 針で子嚢を拾う。ゆっくりと板に針を持ち出す。マイクロニードルの影が見られる、ライ​​ン子嚢を持つこのアップがピックアップされる。円（針の先端）の黒の輪郭が見えるまで、再び針に近づく。このサークルで四分子をタッチしてからすぐに離れて針を引き抜きます。子嚢からすべての4つの子のう胞子が針に付着し、追加の細胞はこの子嚢の一部ではないマイクロニードルで収集されなかったことをしていることを確認します。
5. 遠く離れてプレートからマイクロニードルを引いて、マトリックス（最初の子嚢のため、に行くに行くA1の位置）。子嚢が再配置されるそれぞれの位置をメモしておいてください。マイクロニードルでプレートに触れるとすべての4つの子のう胞子は、マイクロニードルをオフに来るまで引いて、子嚢を下に置きます。ニードルアームまたはYPDプレートを保持しているプラ​​ットフォームの穏やかなタッピングは、この段階ではしばしば有用です。
6. ASCIの希望数が選択されるまで、マトリックス上で連続した位置にステップ3-5と場所ASCIを繰り返します。
7. 各子嚢に戻って、ゆっくりとプラットフォームまたは両方の組み合わせをタップする、針でいじめが離れて4つのセルが壊れる。各子嚢の各子嚢胞子は、4つの行で区切られるまで、マトリックス内の新しい位置の背後にある一つを残して細胞を採取する。
8. ° C成長パターンを観察するために数日間30℃インキュベーターでYPDプレートを置きます。
9. 選択培地にレプリカが板切除した細胞を必要に応じて。

接合体の移転
プロトコル

1. 単一のコロニーを得るために適切な媒体上の反対側の嵌合タイプを持つ2つの半数体系統外ストリーク。
2. メイトこれら二つの菌株は、上述したように、4〜6時間（または一晩、必要に応じて）から成長することができます。
3. 光学顕微鏡下で受精卵を確認してください。受精卵は、芽の有無に関係なくどちらダンベル型のセルとして表示されます。
4. 3ミリメートル接種ループ（細胞がループの¼をカバーしてください）で細胞をピックアップし、無菌のdH ₂ Oの100μLにそっと置く
5. YPDプレート上に接種領域の上部と下部をマーク。
6. 5μL取ると優しく場所は、事前にマークしたYPDプレートの接種領域の行にドロップします。
7. やっと寒天と接触しながら非常にゆっくりとラインの低下を広めるために3ミリメートル接種ループを使用してください。
8. 液体は寒天に吸収することができます。解剖顕微鏡に進みます。
9. フィールドの半分は細胞が含まれており、半分が空であるプレートの領域に焦点を当てる。ゆっくりとそれはフィールドの空の領域に触れるように焦点に針をもたらす。これは、針が前回使用時の細胞が含まれていないことが保証されます。針と寒天との間の接触は、ゆっくりと焦点に入ってくる暗い黒い丸として見られている。
10. 位置A1に行列に移動し、再び寒天を貫通することでマークを付けます。これは、それが完了する前に顕微鏡をオフに実行された場合、プレートの向きを判断することです。
11. 検索モードに切り替えます。受精卵を見つけます。
12. 針との接合子を拾う。
13. 場所は、行列に個別に受精卵。
14. 受精卵が数日間に成長することができます。
15. 適切な選択培地上にレプリカプレートは受精卵。

代表的な結果

図1：反対の交配型の二つの半数体株の交配は、二倍体株を生成します。

図2：温度感受性株（LEU2栄養要求性を持つ）と野生型株（LEU2）との間の交配のTHRE結果（A）YPDプレート。消化細胞は、2つの黒線の間に厚さ成長が見られている左側の接種地域に広がっている。解剖されているASCIは、均等に、右側の行列には等間隔育つ。 （B）（A）のプレートは、SD -ロイシンドロップアウトプレート上に複製されました。検証子嚢胞子が解剖されたことを示すLEU2マーカーの午前2時02分成長に注意してください。 （C）（A）のプレートは、YPDプレート上に複製され、37℃でインキュベートした。さらに子嚢胞子が解剖されたことを検証する2：02の成長に注意してください。

Discussion

酵母の解離は、目的のマーカーを使用して新しい株を選択すると便利なツールです。 four子のう胞子の理論的な成長パターンを決定する際には、栄養細胞の遺伝子型を調べることが重要です。プラスミドが存在する場合、これは子嚢胞子（s）はプラスミドを受信し、操作している菌株について予測し、結論に影響を及ぼすとなる影響を与えるとして、それは、単一のローまたはハイコピーである場合は、1つは知っている必要があります。

特定の株が短期間に多数の子のう胞子を生産する他のものよりも良い胞子を形成することができます。他の株は、子のう胞子の低い割合をもたらす可能性があります。これは、十分な真のASCIを選択することができる限り、実験に影響することはありません。また、株は細胞壁の消化中に異なる反応を示すと、それは経験的に四分子ジュースのインキュベーション時間を調整する必要があります。

目的のマーカーを持つ細胞を選択する場合は、1つは、すべての子のう胞子の成長パターンは、理論的な成長パターンに対応する子嚢からとすべての子のう胞子の大部分は、予想される成長パターンにつながる解剖から来ているものを選択する必要があります。

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Singer MSM System 200	Microscope	Singer Instruments	NA
D-sorbitol	Reagent	BioShop Canada	SOR508
Tris	Reagent	BioShop Canada	TRS001
Zymolyase 100T	Reagent	Seikagaku Corporation	120493
Yeast extract	Reagent	BioShop Canada	YEX401
Peptone	Reagent	BioShop Canada	PEP 403
D-glucose	Reagent	BioShop Canada	GLU501
Yeast nitrogen base	Reagent	BioShop Canada	YNB406
Bio-tryptone	Reagent	BioShop Canada	TRP402
Sodium chloride	Reagent	BioShop Canada	SOD002
Potassium acetate	Reagent	BioShop Canada	POA 301
Agar	Reagent	BioShop Canada	AGR003
Adenine sulfate	Reagent	BioShop Canada	ADS201
L-uracil	Reagent	BioShop Canada	URA 241
L-tryptophan	Reagent	BioShop Canada	TRP 100
L-histidine	Reagent	BioShop Canada	HIS 200
L-arginine	Reagent	Amresco	0877-100G
L-methionine	Reagent	BioShop Canada	MET 222
L-tyrosine	Reagent	BioShop Canada	TYR 333
L-isoleucine	Reagent	BioShop Canada	ISO 910
L-valine	Reagent	BioShop Canada	VAL 201
L-lysine	Reagent	BioShop Canada	LYS 101
L-phenylalanine	Reagent	BioShop Canada	PHA 302
L-glutamic acid	Reagent	BioShop Canada	GLU 202
L-threonine	Reagent	BioShop Canada	THR002
L-leucine	Reagent	BioShop Canada	LEU 222