Summary
Это видео показывает процедуру выделения нетронутыми протопластов из тканей 14-дневных проростков арабидопсиса. Учитывая, что изолированных протопластов остаются неизменными, по крайней мере 96 ч и изолированы от саженцев, а не один-месячного взрослых растений, эта процедура ускоряет анализов требует нетронутыми протопластов.
Abstract
Протопласты растительных клеток, которые имели их клеточных стенок ферментативно удалены. Выделение протопластов из различных растительных тканях впервые сообщили о более чем 40 лет назад
Protocol
Часть 1. Подготовка твердой среде для выращивания растений.
Как правило, мы культура растений на сосредоточена Murasige и Скуга (MS) среде с добавлением 1% сахарозы и 0,7% агара. Он содержит все необходимые ингредиенты сохранить растения здоровыми.
Для приготовления 1 л MS, СМИ рН 5,7
- Добавить 2,15 г MS порошка в 800 мл воды в 1,5-2.0L автоклавируемый бутылку.
- Место мешалкой в бутылку и растворить порошок MS перемешиванием среды на перемешивание пластины.
- При перемешивании, добавлять по капле, 1н KOH для регулировки рН среды MS до 5,7.
- Добавьте 10 г сахарозы, продолжайте перемешивание.
- Добавить 7 г агар *.
- Отрегулируйте конечного объема готовой среды до 1000 мл и стерилизуют в автоклаве .*
- Место автоклавного среды на перемешивание тарелку и охладить при помешивании, чтобы агар не будет осадка на дне бутылки. Охладить среднего ~ 60 ° C. *
- Залить 100 мм чашки Петри. Храните пластины при температуре 4 ° C.
* Совет 1: Не пытайтесь растворить агар. Это будет растворить в автоклаве.
* Совет 2: Хранить мешалкой в бутылки во время автоклавирования, вы будете нуждаться в этом позже.
* Совет 3: Если Вы можете держать вас в руках бутылка автоклаве в течение 10 с, то это означает, что среда имеет достаточно остыла, и вы можете начать заливки плит.
Часть 2. Растительного материала и условий роста.
- Стерилизовать семена Arabidopsis thaliana
- Разместить 100 мг семян в пробирки Эппендорф микроцентрифужных и добавьте 1 мл 70% этанола. Хорошо перемешать и выдержать в течение 2 мин. Спиновые семена вниз, аспирация супернатант.
- Добавить 1 мл 1,8% раствор хлорки *, содержащий 0,1% Твин-20. Смешайте в течение 10 мин. Спином вниз семена и аспирации отбеливающим раствором.
- Этот шаг нужно сделать в ламинарном боксе. Добавьте 1 мл стерильной воды для семян, хорошо перемешать. Спином вниз семена, аспирация воды. Повторите этот шаг в 5 раз.
- Распространение семян на подготовленную на шаге 1 пластинами (100 семян / пластины).
- Держите посеяны пластин в течение 24-48 ч при 4 ° С в темноте в течение стратификации.
- Выращивать растения в течение 14 дней в ростовой камере с 8 ч light/16 ч темно фотопериода (на фотосинтетический плотность потока фотонов в 250 мкмоль м -2 с -1) при 23 / 19 ° C светлый / темный температурного режима и 75% относительной влажность.
* Совет 1: Bleach решение выдуманные путем разбавления бытовых Clorox, содержащий 6% гипохлоритом натрия и добавлением твин-20 до конечной концентрации 0,1%.
Часть 3. Выделение протопластов из Arabidopsis саженцев.
- Фрагмент 2 г 14-дневных проростков со свежим лезвием в 15 мл фильтр-стерилизовать ТВЛ решение. Мы нарезать растительного материала в стерильные одноразовые чашки Петри.
- Передача нарезанной ткани в 200 мл стакан, добавить 20 мл фильтр-стерилизовать раствор фермента, вихрем стакан, чтобы смешать с тканями раствора фермента, накрыть парафильмом и алюминиевой фольги.
- Встряхните растительных тканей на 35 мин в темноте при комнатной температуре в течение 16-18 ч.
- Сбор выпущен протопластов в 50 мл трубки Сокол путем просеивания через 8 слоев сыра тканью, предварительно мокрые в W5 решение.
- Сито протопластов из сыра тканью еще раз промывкой ткани с 15 мл W5 решение.
- Тщательно наложения протопластов с 10 мл W5 решение, не мешайте сахар градиента; центрифуги в течение 7 минут при температуре 100 г.
- Соберите 10 мл протопластов на стыке решения ферментов и W5 Решение (рис. 1б) и переход к новой трубки 50 мл Falcon.
- Добавьте 15 мл W5 Solution, центрифуги в течение 5 мин при 60 g. Удалить супернатант.
- Вымойте протопластов свободным от Фермент Решение ресуспендированием протопластов в 15 мл W5 Solution, центрифуга для 5 мин при 60 г
- Удалить супернатант, ресуспендируют гранулированный протопластов в 1-3 мл W5 решение.
- Оценка протопластов выходом подсчета клеток с гемоцитометра.
Часть 4. Реагенты:
ТВЛ: 0,3 М сорбит; 50 мМ CaCl 2 Фильтр-стерилизовать и хранить при температуре -20 ° C.
Фермент Решение: 0,5 М сахарозы, 10 мМ MES-КОН [рН 5,7], 20 мМ CaCl 2, 40 мМ KCl, 1% Целлюлаза (Onozuka R-10), 1% Macerozyme (R10). Фильтр-стерилизовать и недавно использования.
W5 Решение: 0,1% (м / о) глюкозы, 0,08% (м / о) KCl, 0,9% (м / о) NaCl, 1,84% (м / о) CaCl 2, 2 мМ MES-КОН рН 5,7. Фильтр-стерилизовать и хранить при комнатной температуре.
Часть 5: Представитель Результаты:
Использование Arabidopsis условиях культуры описанные в частях 1 и 2 оказывает здорового посадочного материала, пригодного для изоляции протопластов (рис. 1А). Протопластов очищают градиентом плотности сахарозыцентрифугирования ЛОР и собранные на стыке W5 и ферментов решений (рис. 1б). Использование протопластов изоляции процедуре, описанной в части 3 мы обычно урожай 5-10 10 6 интактных протопластов (рис. 1C) из одного грамма свежей рассады.
Рисунок 1. Выделение протопластов из Arabidopsis саженцев. , Тканей из 14-дневных проростков арабидопсиса были собраны и преобразованы в протопластов на изменение процедуры (Chen и Halkier, 2000). B, протопластов очищали сахарозы центрифугирования в градиенте плотности и собранные на границе раствора фермента и W5 uffer (белые стрелки). C, светлая микроскопии протопластов. Микрофотографии были собраны, используя охлаждением ПЗС-камеры с интерфейсом Axioscope Zeiss 2 плюс микроскопом.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Для обеспечения высокого выхода интактных протопластов это очень важно для запуска со здоровыми растениями. Использовать фильтр-стерилизовать решения для выделения протопластов. Помните, что протопласты хрупкой. Поэтому, когда вы обращаетесь протопластов, не смешиваются, пипетки или вихревые их энергично, поскольку она будет тормозить их. Вместо этого, смешать протопластов на медленно вращающихся или скрепляются клейкой лентой центрифуге трубки. Описанная процедура выхода нетронутыми протопластов, которые являются жизнеспособными в течение не менее 96 ч. Таким образом, протопласты могут быть использованы для изучения различных клеточных процессов, таких как внутриклеточную локализацию белков, изоляция и анализа интактных органелл и целевого гена-инактивации двухцепочечной РНК-интерференция (RNAi) и т. д. 3-5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Предварительный патент описывающий эту процедуру для его использования в функциональный анализ генов растений были поданы с Корнелл Центр корпоративных технологий и коммерциализации (CCTEC), июнь 2008 года. Ярлык Нет 50341/015001: Vatamaniuk, OK, и Чжай, З. Метод быстрого функционального анализа растительных генов.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Корнельского университета Сельскохозяйственной Экспериментальной Станции (CUAES) Нью-Йоркской-125433 Hatch Грант и Корнельский Start-Up Грант присуждается OKV
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MurashigeandSkoogBasalSaltMixture(MS) | Sigma-Aldrich | M5524 | |
| Agar | Sigma-Aldrich | A1296 | |
| PetriDishes(100x15mm) | Krackeler Scientific, Inc. | 82-4001 | |
| Cellulase(OnozukaR‐10) | Research Products International Corp. | C32200 | |
| Macerozyme(R10) | Research Products International Corp. | M22010 | |
| Cheeseclothwipes | Fisher Scientific | 06-665-29 | |
| LabRotator | Fisher Scientific | 1167152Q | |
| AllegraX‐15RCentrifuge | VWR international | 392932 | |
| Axioskop2PlusMicroscope | Carl Zeiss, Inc. |
References
- Cocking, E. C. A Method for the Isolation of Plant Protoplasts and Vacuoles. Nature. 187, 962-963 (1960).
- Chen, S., Halkier, B. A. Characterization of glucosinolate uptake by leaf protoplasts of Brassica napus. J Biol Chem. 275, 22955-22960 (2000).
- Robert, S., Zouhar, J., Carter, C., Raikhel, N. Isolation of intact vacuoles from Arabidopsis rosette leaf-derived protoplasts. Nat. Protocols. 2, 259-262 (2007).
- Yoo, S. D., Cho, Y. H., Sheen, J. Arabidopsis mesophyll protoplasts: a versatile cell system for transient gene expression analysis. Nat Protoc. 2, 1565-1572 (2007).
- Zhai, Z., Sooksa-nguan, T., Vatamaniuk, O. K. Establishing RNAi as a reverse genetic approach for gene functional analysis in protoplasts. Plant Phys. 149, 642-652 (2009).
