Summary
וידאו זה מציג את נוהל בידוד protoplasts שלם מרקמות של 14 יום בן שתילים של ארבידופסיס. בהתחשב בכך protoplasts מבודדים נותרו על כנן לפחות 96h והם מבודדים שתילים במקום אחד בן חודש צמחים בוגרים, הליך זה מזרז מבחני המחייב protoplasts ללא פגע.
Abstract
Protoplasts נמצאים בתאי צמח כי יש לו קירות התא שלהם הוסר enzymatically. בידוד של protoplasts מרקמות צמח שונים דווח לראשונה יותר מאשר לפני 40 שנה
Protocol
חלק 1. הכנת בינוני מוצק לגידול צמחים.
אנחנו בדרך כלל מפעלי התרבות על מדיום מרוכז (MS) ו Murasige Skoog בתוספת 1% סוכרוז ו אגר 0.7%. הוא מכיל את כל המרכיבים הדרושים כדי לשמור על צמחים בריאים.
להכנת 1 ליטר של MS, מדיה pH 5.7
- הוסף 2.15 גר 'של MS האבקה לתוך 800 מ"ל מים בבקבוק 1.5-2.0L autoclavable.
- המקום בר ערבוב לתוך הבקבוק ואת לפזר אבקת MS ידי ערבוב בינוני על צלחת ערבוב.
- תוך כדי ערבוב, להוסיף טיפה אחר טיפה, 1N KOH להתאים את ה-pH של 5.7 עד בינוני MS.
- מוסיפים 10 גרם של סוכרוז, לבחוש.
- הוסף 7 גרם של אגר *.
- התאמת עוצמת השמע הסופי של המדיום מוכן מ"ל ו - 1000 על ידי לעקר מעוקר .*
- המקום autoclaved בינוני על צלחת בחישה ומצננים אותו תוך ערבוב, כך אגר זה לא המשקע בתחתית הבקבוק. תירגע בינוני ~ 60 ° C. *
- יוצקים 100 מ"מ צלחות פטרי. שמור על צלחות ב 4 ° C.
* טיפ 1: אל תנסה לפזר אגר. זה יהיה solubilize במהלך מעוקר.
* טיפ 2: שמור את בר ערבוב בבקבוק במהלך מעוקר, תצטרך אותו יותר מאוחר.
* טיפ 3: אם אתה יכול לשמור את הידיים על הבקבוק autoclaved במשך 10 שניות, זה אומר בינוני יש התקרר מספיק ואתה יכול להתחיל לשפוך צלחות.
חלק 2. הצמח חומר ותנאי הגידול.
- לעקר זרעי thaliana ארבידופסיס
- מקום 100 מ"ג של זרעי לתוך צינורות Eppendorf microcentrifuge ולהוסיף 1 מ"ל של אתנול 70%. מערבבים היטב דגירה דקות 2. ספין זרעים מטה, לשאוב supernatant.
- הוסף 1 מ"ל של תמיסת אקונומיקה 1.8% * המכיל 0.1% Tween-20. מערבבים במשך 10 דקות. ספין למטה זרעים פתרון אקונומיקה לשאוב.
- צעד זה חייב להיעשות במנדף זרימה למינרית. הוסף 1 מ"ל של מים סטריליים כדי זרעים, ומערבבים היטב. ספין למטה זרעים, לשאוב מים. חזור על פעולה זו 5 פעמים.
- מורחים על גבי זרעים מוכן בשלב 1 צלחות (100 זרעים / צלחת).
- שמור על צלחות seeded עבור 24-48 שעות ב 4 ° C בחושך עבור ריבוד.
- לגדל צמחים במשך 14 ימים בתא צמיחה עם 8 שעות light/16 h photoperiod כהה (צפיפות השטף פוטוסינתטיים פוטון של 250 μmol s -1 m -2) ב 23 / 19 ° C אור / חושך משטר הטמפרטורה היחסית 75% לחות.
* טיפ 1: פתרון Bleach היא מאופרת על ידי דילול משק בית Clorox, המכיל נתרן hypochlorite 6% והוספת Tween-20 לריכוז סופי של 0.1%.
חלק 3. בידוד של protoplasts מן השתילים ארבידופסיס.
- פורסים 2 גרם של 14 יום בן שתילים בסכין גילוח טרי 15 מ"ל של פתרון, מסנן מעוקרים TVL. אנחנו קוצצים חומר צמח חד פעמיות צלחות פטרי סטרילי.
- העברת רקמות קצוץ לתוך כוס 200 מ"ל, להוסיף 20 מ"ל של פתרון אנזימים פילטר מעוקרים, לערבל את הגביע כדי לאפשר לרקמות לערבב עם פתרון אנזימים, מכסים בנייר אלומיניום parafilm ו.
- Shake רקמות צמח ב 35 סל"ד בחושך בטמפרטורת החדר למשך 16-18 ח
- אסוף את protoplasts שוחרר לתוך צינור פלקון 50 מ"ל ידי סנון עד 8 שכבות של בד גבינה, טרום רטוב פתרון W5.
- Sieve protoplasts מפעם אחת גבינה בד יותר על ידי שטיפת בד עם 15 מ"ל של פתרון W5.
- בזהירות protoplasts כיסוי עם 10 מ"ל של פתרון W5, נא לא להפריע שיפוע סוכר; צנטריפוגות 7 דקות ב 100 גרם
- איסוף של 10 מ"ל protoplasts על הממשק של פתרון האנזים W5 פתרון (איור 1B) ומעבירים צינור חדש פלקון 50 מ"ל.
- הוסף 15 מ"ל W5 פתרון, צנטריפוגות במשך 5 דקות ב 60 גרם הסר את supernatant.
- לשטוף protoplasts ללא פתרון על ידי אנזימים resuspending protoplasts בצנטריפוגה 15 מ"ל של W5 פתרון, עבור 5min ב 60 גרם
- הסר את supernatant, protoplasts pelleted resuspend בפתרון W5 1-3ml.
- הערכת התשואה protoplast על ידי תא סופר עם hemocytometer.
חלק 4. ריאגנטים:
TVL: 0.3 M סורביטול, 50 מ"מ CaCL 2 Filter-לעקר ולאחסן ב -20 ° C.
הפתרון אנזימים: סוכרוז 0.5 M, 10 mM MES-KOH [pH 5.7], 20 מ"מ CaCl 2, 40 mM KCl, cellulase 1% (Onozuka R-10), Macerozyme 1% (R10). מסנן לעקר טרי להשתמש.
W5 פתרון: 0.1% (w / v) גלוקוז, 0.08% (w / v) KCl, 0.9% (w / v) NaCl, 1.84% (w / v) CaCl 2, 2 מ"מ MES-KOH pH 5.7. מסנן לעקר ולאחסן בטמפרטורת החדר.
חלק 5: תוצאות נציג:
תנאי שימוש תרבות ארבידופסיס המתואר חלקים 1 ו 2 הופך שתילים בריאים, מתאים לבודד protoplasts (איור 1A). Protoplast הם מטוהרים על ידי צפיפות סוכרוז gradient צנטריפוגה ואסף על הממשק של W5 פתרונות אנזימים (איור 1B). באמצעות בידוד protoplast ההליך המתואר בפרק 3 אנו בדרך כלל הקציר 05-10 אוקטובר 6 של protoplasts שלמים (איור 1C) מ גרם אחד של שתילים רעננים.
באיור 1. בידוד של protoplasts מן השתילים ארבידופסיס. , רקמות מ -14 יום בן שתילים של ארבידופסיס נאספו המרה protoplasts על ידי הליך של שינוי (חן Halkier, 2000). B, Protoplasts היו מטוהרים על ידי צנטריפוגה צפיפות סוכרוז שיפוע ואסף על הממשק של תמיסת האנזים W5 uffer (חיצים לבנים). C, מוארת שדה מיקרוסקופית של protoplasts. Microphotographs נאספו באמצעות מצלמה מקורר CCD interfaced עם Axioscope Zeiss 2 פלוס מיקרוסקופ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כדי להבטיח תשואה גבוהה של protoplast שלם חשוב מאוד start-up עם צמחים בריאים. שימוש במסנן-לעקר פתרונות לבידוד protoplasts. זכור כי protoplasts שבירים. לכן, כאשר אתה מטפל protoplasts, לא מתערבבים, pipet או מערבולת אותם נמרצות מאז זה יהיה בלם אותם. במקום זאת, לערבב protoplasts ידי מסתובב לאט או מקליטה את הצינור צנטריפוגות. התשואה תיאר הליך protoplasts שלם כי הם קיימא לפחות 96 ח לכן, protoplasts ניתן ללמוד מגוון רחב של תהליכים תאיים, כגון לוקליזציה subcellular של חלבונים, בידוד ומנתח של אברונים שלמים ממוקד גנים איון על ידי פעמיים תקועים התערבות RNA (RNAi), וכו '3-5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
הפטנט הזמנית המתאר הליך זה לשימושו מנתח פונקציונלית של גנים צמח הוגשו עם קורנל המרכז Enterprise טכנולוגיה מסחור (CCTEC), יוני 2008. יומן לא 50341/015001: Vatamaniuk, אישור Zhai, שיטת Z. עבור ניתוחים פונקציונלי מהיר של גנים צמחיים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי תחנת אוניברסיטת קורנל ניסוי חקלאי (CUAES) NYC-125433 הצוהר גרנט קורנל Start-Up גרנט הוענק OKV
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MurashigeandSkoogBasalSaltMixture(MS) | Sigma-Aldrich | M5524 | |
| Agar | Sigma-Aldrich | A1296 | |
| PetriDishes(100x15mm) | Krackeler Scientific, Inc. | 82-4001 | |
| Cellulase(OnozukaR‐10) | Research Products International Corp. | C32200 | |
| Macerozyme(R10) | Research Products International Corp. | M22010 | |
| Cheeseclothwipes | Fisher Scientific | 06-665-29 | |
| LabRotator | Fisher Scientific | 1167152Q | |
| AllegraX‐15RCentrifuge | VWR international | 392932 | |
| Axioskop2PlusMicroscope | Carl Zeiss, Inc. |
References
- Cocking, E. C. A Method for the Isolation of Plant Protoplasts and Vacuoles. Nature. 187, 962-963 (1960).
- Chen, S., Halkier, B. A. Characterization of glucosinolate uptake by leaf protoplasts of Brassica napus. J Biol Chem. 275, 22955-22960 (2000).
- Robert, S., Zouhar, J., Carter, C., Raikhel, N. Isolation of intact vacuoles from Arabidopsis rosette leaf-derived protoplasts. Nat. Protocols. 2, 259-262 (2007).
- Yoo, S. D., Cho, Y. H., Sheen, J. Arabidopsis mesophyll protoplasts: a versatile cell system for transient gene expression analysis. Nat Protoc. 2, 1565-1572 (2007).
- Zhai, Z., Sooksa-nguan, T., Vatamaniuk, O. K. Establishing RNAi as a reverse genetic approach for gene functional analysis in protoplasts. Plant Phys. 149, 642-652 (2009).
