Summary
这个视频展示了从14日龄拟南芥幼苗组织中分离完整的原生质体的过程。此过程加快，原生质体保持不变的至少96小时，是从，而不是一月龄成熟的植物幼苗孤立的，需要完整的原生质体的检测。
Abstract
原生质体是植物细胞有细胞壁酶去除的。超过40年前首次报道从不同植物组织的原生质体的分离
Protocol
第1部分。制备固体培养基上生长的植物。
我们通常集中Murasige和Skoog（MS）培养基上的文化植物辅以1％蔗糖和0.7％的琼脂。它包含了所有必要的成分，保持健康的植物。
准备介质pH值5.7的MS，1L
- 在1.5 - 2.0L高压灭菌瓶，加入到800毫升的水的MS粉2.15克。
- 放置一个搅拌棒装入瓶中，并解散MS粉搅拌，搅拌板介质。
- 边搅拌，加，一滴一滴，1N氢氧化钾MS培养基的pH值调整到5.7。
- 添加10克的蔗糖，不断搅拌。
- 添加7克，琼脂*
- 调整的准备介质的最终体积1000毫升，并通过高压灭菌消毒.*
- 广场蒸压中等搅拌板，边搅拌冷却下来，因此，琼脂不会沉淀在瓶底。降温介质〜60 ° C。
- 倒入100毫米的Petri板。 '保持在4板° C。
*提示1：不要试图解散琼脂。它会溶解在高压灭菌。
*提示2：保持在高压灭菌过程中瓶中的搅拌棒，你会用到它。
*提示3：如果你能保持你的手10秒的灭菌瓶，这意味着中期有足够的冷却下来，你就可以开始浇筑板。
第2部分。植物材料和生长条件。
- 消毒拟南芥的种子
- 的Eppendorf离心管放入种子100毫克，加1毫升70％的乙醇。充分混匀，孵育2分钟。自旋种子，吸出上清液。
- 添加1.8％的漂白粉溶液1毫升含0.1％Tween - 20的。混合10分钟。离心种子和吸出的漂白粉溶液。
- 这一步要在层流罩。添加1毫升无菌水的种子，拌匀。离心种子，吸水。重复此步骤5次。
- 传播到在步骤1片（100粒种子/盘）准备的种子。
- 种子板块保持在4 ° 24 - C在暗分层。
- 种植植物在生长室为14天8小时light/16 h黑暗光照（250μmol米-2 s - 1时光合作用光子通量密度）和75％，23 / 19 ° C光/暗温度政权的相对湿度。
*提示1：漂白溶液稀释一个家喻户晓的Clorox公司，含有6％次氯酸钠和Tween - 20的加入终浓度为0.1％。
第3部分。 拟南芥原生质体的分离。
- 14日龄的幼苗在15毫升过滤灭菌电视线解决方案的新鲜刀片切片2克。一次性无菌培养皿中，我们砍的植物材料。
- 切碎组织转移到200毫升烧杯中，加20毫升过滤灭菌的酶液，摇动烧杯，让组织与酶液混合，用封口膜，铝箔盖。
- 摇植物组织，在黑暗中在35 RPM，在室温为16-18小时
- 通过8层纱布，在W5的解决方案预湿筛，收集到50毫升猎鹰管释放的原生质体。
- 筛原生质体经水洗布W5的解决方案与15毫升的奶酪布更多的时间。
- 小心覆盖W5的解决方案与10毫升的原生质体，不干扰糖梯度;离心7分钟100克。
- 收集在10毫升原生质体的酶液和W5解决方案（图1B）接口，并转移到一个新的50毫升猎鹰管。
- 添加15毫升W5的解决方案，离心5分钟，在60克去除上清。
- 在60克resuspending15毫升的W5的解决方案，离心机原生质体原生质体酶液洗5min后
- 取出上清，悬浮颗粒的原生质体在13毫升W5的解决方案。
- 评估与血球计数细胞原生质体的产量。
第4部分。试剂：
电视线：0.3 M山梨醇; 50毫米氯化钙2过滤消毒，并保存在-20 ° C 。
酶溶液：0.5 M的蔗糖，MES - KOH pH值5.7，20毫米10毫米氯化钙 ，氯化钾40毫米，1％的纤维素酶（Onozuka R - 10），1％Macerozyme（R10） 。过滤，消毒和新鲜使用。
W5的解决方案：0.1％（W / V）葡萄糖，0.08％（W / V）的氯化钾，0.9％（W / V）氯化钠，1.84％（W / V），2毫米的MES KOH pH值5.7 氯化钙 。过滤，消毒和存放在室温下。
第5部分：代表性的成果：
拟南芥文化1和第2部分中所描述的条件，呈现健康苗，适合于分离原生质体（图1A）。原生质体纯化蔗糖密度梯度耳鼻喉科离心和W5和酶的解决方案（图1B）接口收集。使用第3部分中所描述的原生质体分离过程中，我们通常的收获从一克新鲜苗 5-10完整的原生质体10 6（图1C）。
图1。拟南芥原生质体的分离 。 ，14日龄拟南芥幼苗组织收集，并转换为原生质体修改的过程（陈和Halkier，2000年），B，原生质体纯化蔗糖密度梯度离心法和酶液界面收集和W5的uffer（ 白色箭头 ），C，原生质体的明场显微镜。显微收集使用冷却CCD相机与蔡司Axioscope 2加显微镜接口。
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Discussion
为了确保完整的原生质体的产量高，它是非常重要的启动与健康的植物。使用过滤消毒隔离原生质体解决方案。记住，原生质体是脆弱的。因此，当你正在处理的原生质体时，不要混用，吸管或涡他们大力，因为这将制动他们。相反，混合，通过缓慢旋转或胶带的离心管中的原生质体。所描述的过程产量完整的原生质体是可行的至少96小时。因此，原生质体，可用于研究各种细胞过程，如蛋白质的亚细胞定位，隔离和完整的细胞器和有针对性的双链RNA干扰（RNAi）等3-5基因失活的分析，。
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Disclosures
与康奈尔大学的科技企业和商业化中心（CCTEC），2008年6月已提交临时专利，其在植物基因功能分析的使用说明此过程。文案没有50341/015001：Vatamaniuk，确定，和翟，Z快速的植物基因功能分析的方法。
Acknowledgments
这项工作是由美国康奈尔大学农业试验站（CUAES）NYC - 125433哈奇格兰特和康奈尔大学的支持，启动拨款，批到OKV
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MurashigeandSkoogBasalSaltMixture(MS) | Sigma-Aldrich | M5524 | |
| Agar | Sigma-Aldrich | A1296 | |
| PetriDishes(100x15mm) | Krackeler Scientific, Inc. | 82-4001 | |
| Cellulase(OnozukaR‐10) | Research Products International Corp. | C32200 | |
| Macerozyme(R10) | Research Products International Corp. | M22010 | |
| Cheeseclothwipes | Fisher Scientific | 06-665-29 | |
| LabRotator | Fisher Scientific | 1167152Q | |
| AllegraX‐15RCentrifuge | VWR international | 392932 | |
| Axioskop2PlusMicroscope | Carl Zeiss, Inc. |
References
- Cocking, E. C. A Method for the Isolation of Plant Protoplasts and Vacuoles. Nature. 187, 962-963 (1960).
- Chen, S., Halkier, B. A. Characterization of glucosinolate uptake by leaf protoplasts of Brassica napus. J Biol Chem. 275, 22955-22960 (2000).
- Robert, S., Zouhar, J., Carter, C., Raikhel, N. Isolation of intact vacuoles from Arabidopsis rosette leaf-derived protoplasts. Nat. Protocols. 2, 259-262 (2007).
- Yoo, S. D., Cho, Y. H., Sheen, J. Arabidopsis mesophyll protoplasts: a versatile cell system for transient gene expression analysis. Nat Protoc. 2, 1565-1572 (2007).
- Zhai, Z., Sooksa-nguan, T., Vatamaniuk, O. K. Establishing RNAi as a reverse genetic approach for gene functional analysis in protoplasts. Plant Phys. 149, 642-652 (2009).
