Summary
Cette vidéo montre une procédure permettant d'isoler des protoplastes intacts les tissus à partir de 14 jours d'âge des plants d'Arabidopsis. Étant donné que les protoplastes isolés restent intacts pendant au moins 96h et sont isolées de plants au lieu d'un mois, les plantes matures, cette procédure accélère les essais nécessitant protoplastes intacts.
Abstract
Les protoplastes sont des cellules végétales qui ont eu leurs parois cellulaires enzymatiquement enlevé. Isolement de protoplastes à partir des tissus végétaux différents a été signalé plus de 40 ans
Protocol
Partie 1. Préparation du milieu solide pour les plantes en croissance.
Nous généralement des plantes de culture sur concentrée Murasige et Skoog (MS) supplémenté avec 1% de saccharose et d'agar 0,7%. Il contient tous les ingrédients nécessaires pour garder les plantes saines.
Pour préparer 1L de MS, les médias pH 5,7
- Ajouter 2,15 g de MS poudre dans 800 ml d'eau dans les bouteilles de 1,5 2.0L autoclavables.
- Placer une barre d'agitation dans la bouteille et de dissoudre la poudre MS par l'agitation moyenne sur une plaque en remuant.
- Tout en remuant, ajouter, goutte à goutte, 1N KOH pour ajuster le pH du milieu MS à 5,7.
- Ajouter 10 g de saccharose, continuez à remuer.
- Ajoutez 7 g d'agar *.
- Réglez le volume final du milieu prêt à 1000 ml et stériliser à l'autoclave .*
- Placez autoclavé moyenne sur une plaque agitation et le refroidir en remuant, de sorte que la gélose se précipitent pas au fond de la bouteille. Refroidir à moyen et à ~ 60 ° C *
- Verser 100 mm boîtes de Pétri. Gardez les plaques à 4 ° C.
* Astuce 1: Ne pas tenter de dissoudre la gélose. Il va solubiliser lors de l'autoclavage.
* Astuce 2: Conserver la barre agitation dans une bouteille lors de l'autoclavage, vous aurez besoin plus tard.
* Astuce 3: Si vous pouvez garder vos mains sur la bouteille autoclavé pendant 10 s, cela signifie que le milieu a suffisamment refroidi et vous pouvez commencer versant plaques.
Partie 2. Le matériel végétal et des conditions de croissance.
- Stériliser les graines d'Arabidopsis thaliana
- Placer 100 mg de graines dans des microtubes Eppendorf et ajoutez 1 ml d'éthanol à 70%. Bien mélanger et incuber pendant 2 min. Spin graines vers le bas, aspirer le surnageant.
- Ajouter 1 ml d'eau de Javel à 1,8% * contenant 0,1% de Tween-20. Mélangez pendant 10 min. Isoler les graines et l'eau de Javel aspirer.
- Cette étape doit être effectuée sous une hotte à flux laminaire. Ajouter 1 ml d'eau stérile pour les graines, bien mélanger. Isoler les graines, aspirer l'eau. Répétez cette étape 5 fois.
- Disséminer les graines sur le prêt à l'étape 1 plaques (100 graines / plaque).
- Gardez plaques ensemencées pendant 24-48 h à 4 ° C dans l'obscurité pour la stratification.
- Faites pousser des plantes pendant 14 jours dans la chambre de croissance de 8 h light/16 photopériode h d'obscurité (à une densité de flux de photons photosynthétiques de 250 pmol m -2 s -1) à 23 / 19 ° C de température régime clair / sombre et relative de 75% l'humidité.
* Astuce 1: solution de Bleach est confectionnés par dilution une Clorox ménage, contenant l'hypochlorite de sodium à 6% et en ajoutant de Tween-20 à une concentration finale de 0,1%.
Partie 3. Isolement de protoplastes à partir de plants d'Arabidopsis.
- Trancher 2 g de 14 jours d'âge des plants avec une lame de rasoir propre dans 15 ml de solution stérilisée par filtration TVL. Nous hachez matériel végétal dans des boîtes de Petri stériles jetables.
- Transfert tissus découpés en 200 bécher, ajouter 20 ml de solution d'enzyme stérilisée par filtration, tourbillonner le bécher de laisser mélanger les tissus grâce à la solution enzymatique, couvrir avec du parafilm et papier d'aluminium.
- Secouer les tissus végétaux à 35 min dans le noir à température ambiante pendant 16-18 h.
- Recueillir les protoplastes libérés dans le tube Falcon de 50 ml par tamisage à 8 couches de la toile à fromage, pré-humide dans W5 solution.
- Protoplastes tamis du étamine une fois de plus en lavant le linge avec 15 ml de solution W5.
- Soigneusement protoplastes superposition avec 10 ml de solution W5, ne pas déranger le gradient de sucre; centrifugeuse pendant 7 min à 100 g.
- Recueillir 10 ml de protoplastes à l'interface de solution d'enzyme et W5 Solution (Fig. 1B) et transférer dans un nouveau tube Falcon de 50 ml.
- Ajouter 15 ml de solution W5, centrifuger 5 min à 60 g. Enlever le surnageant.
- Lavez protoplastes libre de solution enzymatique par remise en suspension de protoplastes dans 15ml de solution W5, centrifugeuse pour 5min à 60 g
- Retirer le surnageant, resuspendre protoplastes granulés dans 1-W5 3ml de solution.
- Évaluer le rendement de protoplastes par comptage cellulaire avec un hématimètre.
Partie 4. Réactifs:
TVL: 0,3 M sorbitol, 50 mM CaCl2 Filtre-stériliser et conserver à -20 ° C.
Solution enzymatique: 0,5 M de saccharose, 10 mM MES-KOH [pH 5,7], 20 mM de CaCl2, 40 mM de KCl, 1% de cellulase (Onozuka R-10), Macerozyme 1% (R10). Filtre-stériliser et fraîchement utilisation.
W5 Solution: 0,1% (p / v) de glucose, 0,08% (p / v) de KCl, 0,9% (p / v) de NaCl, 1,84% (p / v) de CaCl 2, 2 mM MES-KOH pH 5,7. Filtre-stériliser et stocker à température ambiante.
Partie 5: Résultats du représentant:
En utilisant des conditions de culture d'Arabidopsis décrits dans les parties 1 et 2 rend des plants sains, adaptés pour isoler des protoplastes (figure 1A). Protoplastes sont purifiés par la densité de saccharose Gradicentrifugation ent et recueillies à l'interface de W5 et Solutions enzymatiques (Fig. 1B). En utilisant la procédure décrite dans l'isolement de protoplastes Partie 3 nous avons généralement la récolte 5 à 10 octobre 6 de protoplastes intacts (Fig. 1C) à partir d'un gramme de plants frais.
Figure 1. Isolement de protoplastes à partir de plants d'Arabidopsis. A partir de tissus de 14 jours, âgé de plants d'Arabidopsis ont été recueillies et converties en protoplastes par une procédure modifiée d'(Chen et Halkier, 2000). B, protoplastes ont été purifiées par centrifugation sur gradient de densité de saccharose, et recueillis à l'interface de la solution enzymatique et W5 Uffer (flèches blanches). C, Bright microscopie à champ de protoplastes. Microphotographies ont été recueillies à l'aide d'une caméra CCD refroidie interfacé avec le Axioscope Zeiss 2 plus microscope.
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Discussion
Pour assurer le rendement élevé de protoplastes intacts, il est très important de start-up avec des plantes saines. Utiliser un filtre de stériliser des solutions pour isoler des protoplastes. Rappelez-vous que les protoplastes sont fragiles. Par conséquent, lorsque vous manipulez des protoplastes, ne pas mélanger, pipette ou vortex entre eux vigoureusement, car il va les freiner. Au lieu de cela, le mélange protoplastes par rotation lente ou de l'enregistrement du tube à centrifuger. Les protoplastes décrit la procédure de rendement intactes qui sont viables pendant au moins 96 h. Par conséquent, les protoplastes peuvent être utilisées pour étudier une variété de processus cellulaires tels que la localisation subcellulaire des protéines, l'isolement et l'analyse des organites intacts et ciblée du gène-inactivation par l'ARN double brin d'interférence ARN (ARNi), etc 3-5.
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Disclosures
Le brevet provisoire décrivant la procédure pour son utilisation dans les analyses fonctionnelles des gènes de plantes ont été déposés auprès de la Cornell Centre pour l'entreprise et commercialisation des technologies (CCTEC), Juin 2008. Dossier Pas 50341/015001: Vatamaniuk, OK, et Zhai, Z. La méthode rapide pour les analyses fonctionnelles des gènes de la plante.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par la Station de l'Université Cornell Agricultural Experiment (CUAES) NYC-125433 Hatch Grant et Cornell Start-Up Subvention accordée aux OKV
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MurashigeandSkoogBasalSaltMixture(MS) | Sigma-Aldrich | M5524 | |
| Agar | Sigma-Aldrich | A1296 | |
| PetriDishes(100x15mm) | Krackeler Scientific, Inc. | 82-4001 | |
| Cellulase(OnozukaR‐10) | Research Products International Corp. | C32200 | |
| Macerozyme(R10) | Research Products International Corp. | M22010 | |
| Cheeseclothwipes | Fisher Scientific | 06-665-29 | |
| LabRotator | Fisher Scientific | 1167152Q | |
| AllegraX‐15RCentrifuge | VWR international | 392932 | |
| Axioskop2PlusMicroscope | Carl Zeiss, Inc. |
References
- Cocking, E. C. A Method for the Isolation of Plant Protoplasts and Vacuoles. Nature. 187, 962-963 (1960).
- Chen, S., Halkier, B. A. Characterization of glucosinolate uptake by leaf protoplasts of Brassica napus. J Biol Chem. 275, 22955-22960 (2000).
- Robert, S., Zouhar, J., Carter, C., Raikhel, N. Isolation of intact vacuoles from Arabidopsis rosette leaf-derived protoplasts. Nat. Protocols. 2, 259-262 (2007).
- Yoo, S. D., Cho, Y. H., Sheen, J. Arabidopsis mesophyll protoplasts: a versatile cell system for transient gene expression analysis. Nat Protoc. 2, 1565-1572 (2007).
- Zhai, Z., Sooksa-nguan, T., Vatamaniuk, O. K. Establishing RNAi as a reverse genetic approach for gene functional analysis in protoplasts. Plant Phys. 149, 642-652 (2009).
