Summary
För att studera utvecklingsprocesser av ascospores i Gibberella zeae, ett förfarande för insamling under sterila förhållanden är filmad för att generera den högsta nivån av information för protokoll beskrivning. Detta bör underlätta reproducerbarhet av experimentet, en avgörande aspekt när den är full genomet uttryck profilen tester genomförs.
Abstract
Fusarium graminearum Schwabe (teleomorph Gibberella zeae) är en växt patogen som orsakar sårskorpa sjukdomar på vete och korn som minskar avkastning och spannmål kvalitet. F. graminearum orsakar också stjälk och öron ruttnar av majs och är en producent av mykotoxiner såsom trikotecener som förorenar spannmål och är skadliga för människor och boskap (Goswami och Kistler, 2004). Svampen producerar två typer av sporer. Ascospores det förökningsmaterial till följd av sexuell reproduktion, är den viktigaste källan av primär infektion. Dessa sporer är med våld ut från mogna perithecia och sprids med vinden (Francl et al 1999). Sekundära infektioner orsakas huvudsakligen av macroconidia som produceras av asexuell betyder på anläggningen ytan. För att studera utvecklingsprocesser av ascospores i den här svampen, var ett förfarande för insamling i stora mängder under sterila förhållanden krävs. Vår protokollet filmades för att generera den högsta nivån av information för förståelse och reproducerbarhet, avgörande aspekter när den är full genomet genexpression profiler genereras och tolkas. I synnerhet variabilitet ascospore groning och biologiska aktiviteten är beroende av tidigare manipulation av materialet. Användningen av video för att dokumentera varje steg i ascospore produktionen föreslås i syfte att öka standardiseringen, som uppfyller allt hårdare krav på microarray analys. Förfarandet kräver endast Vanlig laboratorieutrustning. Åtgärder visas för att förhindra förorening och främja tidssynkronisering av ascospores.
Protocol
- Morot agar (Klittich och Leslie, 1988) har upprättats i 9-cm diameter petriskålar.
- En 2 mm kub av agar med färskt mycel växer på potatis dextros tillämpades på mitten av varje petriskål.
- Kulturer odlades vid 25 ° C och ett 12-h fotoperiod för 96 timmar.
- En ml vattenlösning 2,5% Tween 60 tillämpades på ytan av kultur (Trail och Common, 2000) och spred sig över kulturen med en plast stav, genom att försiktigt trycka.
- Perithecia skytte ascospores utvecklat 7-10 dagar efter denna induktionsbehandling när den förvaras i miljöer med hög luftfuktighet vid 25 ° C med samma fotoperiod.
- Spore samling sker genom att ändra Petri platta locket, lämnar perithecia att skjuta under en begränsad tid (exempelvis 12 timmar) i mörkret.
- Sterilt vatten läggs till i locket, tillfälligt ascospores genom att försiktigt flytta vatten på ytan.
- Ascospores samlas i sterila Falcon rör, tvättas och användas för vidare analys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollet presenteras här bygger på tidigare förfaranden som används för perithecial produktion för Fusarium spp.. (Klittich och Leslie, 1988; Trail och Common, 2000). Standardisering av förfarandet genom vilken stora mängder ascospores (tillräckligt för microarray analys) genererades var avgörande för reproducerbarhet av försöket. Det har rapporterats att miljöfaktorer, ålder och substrat skillnader kan ändra biologiska karaktär ascospores (Beyer och Verreet, 2005). Därför är användning av video kan belysa små detaljer i hur sporer produceras och samlas in som bör underlätta reproducerbarhet. Särskilt videon av förfarandet bör förbättra nivån av standardisering mellan laboratorier och underlätta jämförelsen av hela studier genomet transkription som kräver ascospore produktion. Mängden RNA som behövs för experiment förfarande är relativt hög så ett stort antal petriskålens ska behandlas synkront. Video är ett särskilt lämpligt verktyg när det är nödvändigt att genomföra hela genomet transkriptionell studier av nya biologiskt material, sätta en standard för framtida experiment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Författarna tackar Karen Hilburn för utmärkt teknisk support. Projektet stöddes av National Research Initiative av USDA kooperativa staten forskning, utbildning och Extension Service (Award # 2004-35604-14327). Matias Pasquali stöds av Branco Weiss Fellowship. Den amerikanska vete och korn sårskorpa initiativet är också erkänt för fortsatt stöd till forskningen.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Petri dish 9 cm diameter | Tool | |||
| Tween 60 (20%) | Reagent | |||
| Carrot agar (20% w/v organic carrots and 1.5% w/v agar) | Reagent |
References
- Beyer, M., Verreet, J. A. Germination of Gibberella zeae ascospores as affected by age of spores after discharge and environmental factors. , (2005).
- Francl, L., Shaner, G., Bergstrom, G., Gilbert, J., Pedersen, W., Dill-Macky, R., Sweets, L., Corwin, B., Jin, Y., Gallenberg, D., Wiersma, J. Daily inoculum levels of Gibberella zeae on wheat spikes. Plant Disease 83,662-666. , (1999).
- Goswami, R. S., Kistler, H. C. Heading for disaster, Fusarium graminearum on cereal crops. Molecular Plant Pathology 5,515–525. , (2004).
- Klittich, C. J. R., Leslie, J. F. Nitrate reduction mutants in Fusarium moniliforme (Gibberella fujikuroi. Genetics. 118, 417-2013 (1998).
- Trail, F., Common, R. Perithecium development in Gibberella zeae, a light microscopy study. , (2000).
- Tschantz, A. T., Horst, R. L., Nelson, P. E. A substrate for uniform production of perithecia in Gibberella zeae. Mycologia. , 67-1101 (1975).
- Tschanz, A. T., Horst, R. K., Nelson, P. E. The effect of environment on sexual reproduction of Gibberella zeae. , (1976).
