Summary
Для изучения процессов развития аскоспор в Gibberella zeae, порядок сбора в стерильных условиях снимают с целью получения высокого уровня информации для описания протокола. Это должно способствовать воспроизводимости эксперимента, важный аспект, когда полное выражение проверяет генома профиля реализованы.
Abstract
Fusarium graminearum Швабе (teleomorph Gibberella zeae) является завод патогенный микроорганизм, вызывающий заболевание паршой на пшеницу и ячмень, что снижает урожайность и качество зерна. Ф. graminearum также вызывает стебля и ухо гнилей кукурузы и является производителем микотоксинами, такими как трихотецены, которые загрязняют зерно и вредны для людей и скота (Госвами и Kistler, 2004). Грибок производит два типа спор. Аскоспоры, побегов в результате полового размножения, являются основным источником первичной инфекции. Эти споры принудительно выписали из зрелых перитеции и разносятся ветром (Франкля и др. 1999). Вторичные инфекции, в основном вызваны макроконидий которые производятся бесполым путем на поверхности растения. Для изучения процессов развития аскоспор в этом гриб, порядок их взимания в большом количестве в стерильных условиях не требуется. Наш протокол был снят для того, чтобы генерировать высокий уровень информации для понимания и воспроизводимость; важнейших аспектов при полной профилей генной экспрессии генома создаются и интерпретируются. В частности, изменчивость аскоспор прорастания семян и биологическая активность зависят от предварительного манипуляции материала. Использование видео для документирования каждого шага в аскоспор производства предлагается в целях повышения стандартизации, соблюдения все более строгих требований к анализу микрочипов. Процедура требует лишь стандартным лабораторным оборудованием. Шаги показаны для предотвращения загрязнения и способствуют синхронизации времени аскоспор.
Protocol
- Морковный агар (Klittich и Лесли, 1988) был подготовлен в 9-см в диаметре чашки Петри.
- 2 мм куб агара, содержащего свежего мицелия, выращенных на картофельном агаре декстрозы была применена к центру каждой чашке Петри.
- Культуры выращивали при 25 ° С и 12-ч фотопериода в течение 96 часов.
- Один мл водного 2,5% Твин 60 была применена к поверхности культуры (Trail и общие, 2000) и распределены по культуре с пластиковым стержнем,, слегка нажав.
- Перитеции съемки аскоспор разработан 7-10 дней после индукционной терапии при хранении в условиях высокой влажности при 25 ° С с тем же фотопериода.
- Spore сбор производится за счет изменения крышкой Петри пластины, оставляя перитеции снимать в течение ограниченного времени (например, 12 часов) в темноте.
- Стерильная вода добавляется к крышке, приостановление аскоспор, мягко движущейся воды на поверхности.
- Аскоспоры собирают в стерильные пробирки Falcon, мыть и использовать для дальнейшего анализа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Протокол, представленные здесь, основаны на предыдущих процедур, используемых для производства perithecial Fusarium sрр. (Klittich и Лесли, 1988; Трейл и общие, 2000). Стандартизация процедуры, посредством которой большое количество аскоспор (достаточно для анализа микрочипов) были получены имеет важное значение для воспроизводимости эксперимента. Сообщалось, что экологические факторы, возраст и подложки различия могут изменить биологический характер аскоспор (Beyer и Verreet, 2005). Поэтому использование видео может выявить мелкие детали на пути споры произведены и собраны, что должно способствовать воспроизводимости. В частности видео, процедура должна улучшить уровень стандартизации между лабораториями и облегчить сравнение генома транскрипцию исследований, которые требуют аскоспор производства. Количество РНК необходимые для эксперимента процедура является относительно высокой, так большое количество чашке Петри должны обрабатываться синхронно. Видео является особенно подходящим инструментом, когда необходимо реализовать весь геном транскрипционных исследования нового биологического материала, устанавливая стандарт для будущих экспериментов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Авторы выражают благодарность Карен Хилберн за отличную техническую поддержку. Этот проект был поддержан Национальной исследовательской инициативы государства USDA совместных исследований, образования и продлению обслуживания (премия # 2004-35604-14327). Матиас Pasquali поддерживается Бранко Вайса стипендий. Пшеница США и инициатива Ячмень Парша также признал за постоянную поддержку исследований.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Petri dish 9 cm diameter | Tool | |||
| Tween 60 (20%) | Reagent | |||
| Carrot agar (20% w/v organic carrots and 1.5% w/v agar) | Reagent |
References
- Beyer, M., Verreet, J. A. Germination of Gibberella zeae ascospores as affected by age of spores after discharge and environmental factors. , (2005).
- Francl, L., Shaner, G., Bergstrom, G., Gilbert, J., Pedersen, W., Dill-Macky, R., Sweets, L., Corwin, B., Jin, Y., Gallenberg, D., Wiersma, J. Daily inoculum levels of Gibberella zeae on wheat spikes. Plant Disease 83,662-666. , (1999).
- Goswami, R. S., Kistler, H. C. Heading for disaster, Fusarium graminearum on cereal crops. Molecular Plant Pathology 5,515–525. , (2004).
- Klittich, C. J. R., Leslie, J. F. Nitrate reduction mutants in Fusarium moniliforme (Gibberella fujikuroi. Genetics. 118, 417-2013 (1998).
- Trail, F., Common, R. Perithecium development in Gibberella zeae, a light microscopy study. , (2000).
- Tschantz, A. T., Horst, R. L., Nelson, P. E. A substrate for uniform production of perithecia in Gibberella zeae. Mycologia. , 67-1101 (1975).
- Tschanz, A. T., Horst, R. K., Nelson, P. E. The effect of environment on sexual reproduction of Gibberella zeae. , (1976).
