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Biology

Murino procedura trapianto renale

doi: 10.3791/1150 Published: July 10, 2009

Summary

Trapianto renale nei topi è una procedura tecnicamente impegnativo, che richiede un'attenta assistenza post-operatoria e terapia per il successo.

Abstract

Trapianto renale ortotopico nei topi è una procedura tecnicamente difficile. Anche se il primo trapianto di rene nei topi sono stati eseguiti da Russell et al oltre 30 anni fa (1) e raffinata da Zhang et al anni dopo (2), poche persone al mondo hanno imparato questa procedura. Nel nostro laboratorio abbiamo eseguito con successo 1200 trapianti di rene ortotopico con tasso di sopravvivenza> 90%. I punti chiave per il successo includono il controllo rigoroso del danno da riperfusione, sanguinamento e trombosi, sia durante la procedura e post-trapianto, e l'uso di 10-0 11-0, invece di sutura per anastomosi.

Cure post-operatorie e nel trattamento del destinatario è estremamente importante per il successo dei trapianti e della valutazione. Tutti i destinatari del trapianto di rene ricevere antibiotici sotto forma di un'iniezione di penicillina immediatamente post-trapianto e sulfatrim nell'acqua da bere in continuazione. Salute degli animali complessivo viene valutato quotidianamente e tutto analisi di creatinina nel sangue sono eseguiti di routine con un portatile I-STAT macchina per valutare la funzione del trapianto.

Protocol

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Harvest donatore di organi (2):

  1. Anestetizzare il donatore utilizzando IP pentobarbital 65mg/kg; anestesia è gestito da isoflurano (2-3%).
  2. Eseguire un'incisione mediana da sterno al pube per entrare nel ventre donatore ed esporre il rene sinistro, spostando l'intestino lateralmente sul lato destro.
  3. Isolare il rene sinistro legando e dividendo i vasi surrenali e testicoli con una sutura di seta 8-0.
  4. Mobilitare l'aorta sopra l'incrocio con l'arteria e la vena renale.
  5. Mobilitare la vena cava inferiore (IVC) sopra e sotto l'incrocio con l'arteria e la vena renale.
  6. Legare l'aorta sotto l'arteria e la vena renale con una sutura 8-0 di seta per ridurre al minimo il sanguinamento.
  7. Sezionare dell'uretere sinistro dal ilo renale alla vescica.
  8. Esporre il bivio ureterovesical con retrazione caudale sulla cupola della vescica.
  9. Accise un piccolo cerotto ellittica della vescica contenente il bivio a sinistra ureterovesical, utilizzato per la ricostruzione della vescica urinaria attraverso un-a-anastomosi vescica. L'uretere destro non è incluso con la vescica.
  10. Legare la IVC sotto l'arteria renale e la vena con una sutura di seta 8-0.
  11. Legare l'aorta sopra l'arteria renale e vena, e lentamente profumato l'innesto in situ con 0,2 0,4 ml freddo, eparinizzati soluzione di Ringer lattato attraverso l'aorta sottorenale.
  12. Legare la IVC sopra l'arteria renale e la vena con una sutura di seta 8-0.
  13. Transetto la vena renale al suo incrocio con la IVC.
  14. Dividere l'aorta obliquamente, a circa due millimetri sotto l'arteria renale.
  15. Rimuovere il rene e la sua vascolarizzazione con uretere allegato alla patch vescica in blocco. Conservare in soluzione di Ringer lattato sul ghiaccio.
  16. Euthanize il mouse donatore di dislocazione cervicale in anestesia.

Destinatario trapianto (2):

  1. Anestetizzare il destinatario con 65 mg / kg IP pentobarbital e mantenere l'anestesia con isoflurano (2-3%).
  2. Effettuare una incisione sulla linea mediana, coprire l'intestino con una garza umida e con attenzione lo ritrae sul lato sinistro.
  3. Legare l'uretere destro, l'arteria renale e vena, e rimuovere il rene destro.
  4. Con attenzione isolare e cross-clamp l'aorta sottorenale e IVC con due morsetti microvasular 4 mm dopo legando i rami lombare.
  5. Posizionare un 10-0 sutura in nylon con uno spessore totale di aorta e ritrarre per fare un aortaotomy ellittica con un unico taglio (circa un quinto del diametro del vaso).
  6. Fare un venotomy longitudinale perforando la IVC con un ago 30 gauge e di estendere opportunamente utilizzando microscissors.
  7. Irrigare sia l'aorta e IVC con soluzione salina eparinata per cancellare il sangue intraluminale o coaguli.
  8. Rimuovere il rene del donatore dal ghiaccio e mettetelo intra-addominale nel fianco destro del mouse. Il rene del donatore è tenuto umido con una soluzione salina fredda imbevuta di tampone di garza.
  9. Inserire due punti di sutura rimanere al vertice prossimale e distale del aortaotomy destinatari con il polsino aortico donatori.
  10. Fai un end-to-side anastomosi tra il bracciale aortico donatore e la parete anteriore del aortaotomy destinatari, utilizzando 2 ~ 3 continua 10-0 suture in nylon nella parte esterna dell'aorta.
  11. Girare il trapianto di rene del donatore verso il fianco sinistro del destinatario. ripetere la procedura precedente tra il polsino aortico donatore e la parete posteriore della aortaotomy destinatari
  12. Eseguire un end-to-side anastomosi tra la vena renale donatore e la parete posteriore della IVC destinatari, utilizzando 4-5 10-0 continuo suture in nylon all'interno della IVC. e poi la parete anteriore della vena renale IVC e donatori sono chiusi con 4 ~ 5 punti di sutura continua al di fuori della IVC.
  13. L'anastomosi di entrambi vena e arteria deve essere completato entro 20 minuti.
  14. Sciacquare l'innesto con soluzione fisiologica fredda diverse volte durante l'anastomosi.
  15. Dividere la cupola della vescica destinatario, e fermare le emorragie con cauterizzazione.
  16. Fai un piccolo taglio sulla cupola.
  17. Inserire due suture di 10-0 in nylon per anastomize la piccola macchia vescica donatori con la cupola della vescica destinatari. Ogni lato di anastomosi viene suturata con 8 ~ 10 punti di sutura continua.
  18. Chiudere l'addome in due strati con continue 4-0 sterile, sutura sintetico assorbibile Vicryl.
  19. Dare topi riceventi 0,4 ml soluzione salina calda durante l'intervento chirurgico da intermittenti iniezione ev.

Cure post-operatorie del destinatario

  1. Dopo aver chiuso dell'addome, una singola iniezione intramuscolare di penicillina (500U/10g) è somministrato (2).
  2. Inoltre, i destinatari ricevono 0,05 mg / kg di buprenorfina per via intramuscolare al giorno 0 e 1 ° giorno dopo l'intervento chirurgico per il dolore. Dopo la chirurgia, trapianto di ricevere acqua contenente sulfatrim (100mg/kg) fino a quando l'esperimento è terminated.
  3. Per le prime 24 ore dopo l'intervento topi sono conservati in un incubatore a temperatura controllata.
  4. I topi di solito guariscono da anestesia entro 1 ora dell'operazione e vengono dati cibo normale e acqua ad libitum.
  5. Suture della pelle vengono rimossi 2 settimane dopo l'intervento chirurgico.

Destinatario nefrectomia

  1. Anestetizzare il destinatario 4 ~ 7 giorni dopo il trapianto di rene con 65 mg / kg IP pentobarbital, l'anestesia è gestito da isoflurano (2-3%).
  2. Aperto l'addome attraverso una incisione sulla linea mediana.
  3. Coprire l'intestino con garza imbevuta di soluzione salina e con attenzione lo ritrae sul lato destro.
  4. Rimuovere il rene sinistro dopo legatura sinistra uretere, la vena renale e arteria.
  5. Chiudere l'addome in due strati con continue 4-0 sutura sintetico assorbibile Vicryl.

Sangue intero creatinina Misure

  1. Settimanale per la raccolta del sangue bisettimanale inferiore a 0,2 cc è effettuata sia submandibularly senza anestesia o retro-orbitalmente sotto anestesia isoflurano.
  2. Quantitativa dei livelli di creatinina nel sangue intero sono determinati utilizzando un I-Stat Analyzer Clinica (Portable Heska Corp., Fort Collins, CO).
  3. Unità convenzionali (mg / dl) sono convertiti in unità SI di micromol / L moltiplicando le unità convenzionali da 88,4.

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Discussion

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Abbiamo effettuato circa 1200 casi di trapianto renale nei topi con una percentuale di successo tecnico del> 90%. Rispetto al trapianto di cuore, il tasso di successo del trapianto di rene è solitamente basso. Tuttavia, il nostro laboratorio ha mantenuto un alto tasso di successo (> 90%) del trapianto di rene. I punti chiave per il successo sono per ridurre le lesioni da riperfusione sia donatore di rene e dei destinatari, e ridurre al minimo il sanguinamento e trombosi durante tutta la procedura e post-operatoria. I seguenti fattori possono essere più importanti: (a) nel ridurre il sanguinamento durante l'intervento del destinatario, per quanto possibile attraverso un'operazione attenta e gentile, (b) ridurre al minimo i tempi d'ischemia calda e cross-bloccaggio durante la preparazione del donatore e il ricevente il trapianto di rene, (c) utilizzare un piccolo cerotto vescica dei donatori per evitare necrosi, insufficiente apporto di sangue e perdite vescicale post-operatorio; (d) ritardo nefrectomia del rene nativo fino a 4 ~ 7 giorni dopo il trapianto per permettere al rene trapiantato a recuperare la funzione dopo l'intervento chirurgico, (e ) eseguire anastomosi (tra il polsino aortico donatore e la parete anteriore e tra il bracciale aortico donatore e la parete posteriore dell'aorta del destinatario) al di fuori dell'aorta per ridurre l'incidenza di trombosi, (f) mantenere topi riceventi caldo per almeno 24 ore successive all'intervento; (g) danno antibiotici per topi riceventi post-operatorio per evitare potenziali infezioni.

In questo protocollo, utilizziamo invece di 10-0 11-0 sutura senza influenzare il tasso di sopravvivenza. Anche se il 11-0 sutura è l'ideale e utilizzato in molti laboratori di trapianto, ci sembra che 10-0 sutura è sufficiente per l'utilizzo nei trapianti di rene fino a quando i fattori sopra descritti sono ben controllati.

La rimozione del rene nativo è essenziale in modo che il declino della funzione renale del trapianto può essere monitorato da misurazioni della creatinina sierica. Tutti i destinatari del trapianto di rene subire nefrectomia del rene sinistro nativo tra 4 e 7 giorni dopo il trapianto di rene. Nefrectomia non viene eseguita al momento del trapianto di rene, perché i destinatari tipicamente soffrono problemi di salute o non sopravvivono quando entrambe le procedure sono condotte allo stesso tempo. Un 4-7 lag giorno tra le procedure permette al rene trapiantato a recuperare da un infortunio ischemia e riperfusione prima che il rene nativo viene rimosso. Innesto funzione renale viene valutata dagli esami quotidiana della salute degli animali generale e livelli di creatinina nel sangue. Per avere un riferimento, un non-trapiantati, un mouse normale ha un livello di creatinina di circa 20 micromol / L. Rigetto renale è sospettata quando il mouse destinatario mostra segni di malattia e il livello di creatinina sono elevate quasi 100 micromol / L alla quale innesti momento vengono raccolti per le analisi istopatologica.

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Disclosures

Gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con le linee guida e dei regolamenti previsti dalla Ohio State University IACUC.

Acknowledgments

Questi studi sono stati sostenuti in parte da finanziamenti dal NIH R01 AI36532 a GAH. Vorremmo riconoscere il notevole supporto nel trapianto patologia fornito dal Dr. Tibor Nadasdy, e la guida preziosa e lungimiranza fornito dal compianto Dr. Charles G. Orosz nell'avviare questo sforzo di ricerca.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
i-STAT Other HESKA Cat 5101
i-STAT Cartridge Other HESKA CAT 5110-CREA
Sulfatrim Other Actavis R02109
Isoflurane Other NOVAPLUS CA-0474
10-0 Suture Surgery Sharpoint AK0100

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Russell, P. S., Chase, C. M., Colvin, R. B., Plate, J. M. D. Kidney transplants in mice. An analysis of the immune status of mice bearing long-term, H-2 incompatible transplants. JExpMed. 147, 1449-1468 (1978).
  2. Zhang, Z., Schlachta, C., Duff, J., Stiller, C., Grant, D., Zhong, R. Improved techniques for kidney transplantation in mice. Microsurgery. 16, (2), 103-109 (1995).
Murino procedura trapianto renale
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Cite this Article

Wang, J., Hockenheimer, S., Bickerstaff, A. A., Hadley, G. A. Murine Renal Transplantation Procedure. J. Vis. Exp. (29), e1150, doi:10.3791/1150 (2009).More

Wang, J., Hockenheimer, S., Bickerstaff, A. A., Hadley, G. A. Murine Renal Transplantation Procedure. J. Vis. Exp. (29), e1150, doi:10.3791/1150 (2009).

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