Murine niertransplantatie Procedure

Summary

Niertransplantatie bij muizen is een technisch uitdagend procedure die een zorgvuldige postoperatieve zorg en behandeling voor succes vereist.

Abstract

Nier orthotope transplantatie in muizen is een technisch uitdagend procedure. Hoewel de eerste niertransplantaties bij muizen werden uitgevoerd door Russell et al. meer dan 30 jaar geleden (1) en verfijnd door Zhang et al. jaar later (2), hebben weinig mensen in de wereld onder de knie deze procedure. In ons laboratorium hebben we met succes uitgevoerd 1200 orthotope niertransplantaties met> 90% overlevingskans. De belangrijkste punten voor succes zijn onder strikte controle van de reperfusie schade, bloeden en trombose, zowel tijdens de procedure en na transplantatie, en het gebruik van 10-0 in plaats van 11-0 hechtdraad voor anastomosen.

Post-operatieve zorg en de behandeling van de ontvanger is uiterst belangrijk voor transplantatie succes en evaluatie. Alle niertransplantaat ontvangers krijgen antibiotica in de vorm van een injectie van penicilline onmiddellijk na de transplantatie en sulfatrim in het drinkwater voortdurend. De algemene gezondheid van dieren wordt geëvalueerd dagelijks en volbloed creatinine-analyses worden routinematig uitgevoerd met een draagbare I-STAT machine transplantaatfunctie te beoordelen.

Protocol

Donor Organ Harvest (2):

1. Verdoven van de donor met behulp van 65mg/kg pentobarbital IP; anesthesie wordt onderhouden door Isofluraan (2-3%).
2. Maak een middellijn incisie van borstbeen tot schaambeen aan de donor buik te gaan en de linker nier bloot door het bewegen van de darm zijdelings aan de rechterkant.
3. Isoleer de linker nier door het ligeren en het verdelen van de bijnieren en de testis schepen met een 8-0 zijden hechtdraad.
4. Mobiliseer de aorta boven de kruising met de nierslagader en de ader.
5. Mobiliseer de vena cava inferior (IVC) boven en onder de kruising met de nier-slagader en ader.
6. Afbinden van de aorta onder de nier-slagader en ader met een 8-0 zijden hechtdraad om het bloeden te minimaliseren.
7. Ontleden de linker urineleider van de nier navel naar de blaas.
8. Expose de ureterovesical kruising met behulp van caudale terugtrekken op de blaas koepel.
9. Accijnzen een kleine, elliptische patch van de blaas met de linker ureterovesical kruising, gebruikelijk is voor urinair reconstructie via een blaas-to-blaas anastomose. De juiste ureter wordt niet meegeleverd met de blaas.
10. Afbinden van de IVC onder de nier-slagader en ader met een 8-0 zijden hechtdraad.
11. Afbinden van de aorta boven de nier-slagader en ader, en langzaam het transplantaat in situ perfuseren met 0.2-0,4 ml koud, gehepariniseerd lactaat Ringer's via de infrarenale aorta.
12. Afbinden van de IVC boven de nier-slagader en ader met een 8-0 zijden hechtdraad.
13. Transect de nier-ader op de kruising met het IVC.
14. Schuin Verdeel de aorta, ongeveer 2 mm onder de nierslagader.
15. Verwijder de nier en de vasculaire voorzien ureter verbonden aan de blaas patch en bloc. Bewaren in lactaat Ringer's op het ijs.
16. Euthanaseren de donor muis door cervicale dislocatie onder narcose.

Ontvanger transplantatie (2):

1. Verdoven van de ontvanger met 65 mg / kg pentobarbital IP en onderhouden van de anesthesie door Isofluraan (2-3%).
2. Maak een middellijn incisie, dekking van de darm met natte gaas en voorzichtig trekken naar de linkerkant.
3. Afbinden de rechter ureter, nier-slagader en ader, en verwijder de rechter nier.
4. Zorgvuldig isoleren en cross-klem van de infrarenale aorta en IVC met twee 4-mm microvasular klemmen na ligeren van de lumbale takken.
5. Plaats een 10-0 nylon hechtdraad door middel van een volledige dikte van de aorta en het trekken aan een elliptische aortaotomy te maken door een enkele cut (ongeveer een vijfde van de diameter van het schip).
6. Maak een longitudinale venotomy door piercing de IVC met een 30 gauge naald en uit te breiden met behulp van de juiste microscissors.
7. Spoel zowel de aorta en IVC met gehepariniseerde zoutoplossing om intraluminale bloed of stolsels duidelijk.
8. Haal de donor nier van het ijs en plaats het intra-abdominaal in de rechter flank van de muis. De donor nier wordt vochtig gehouden met een koude zoutoplossing gedrenkt gaasje.
9. Plaats twee hechtingen verblijf in de proximale en distale top van de ontvangers aortaotomy met de donoren aorta manchet.
10. Maak een end-to-side anastomose tussen de donor aorta manchet en de voorste wand van de ontvangers aortaotomy, met behulp van 2 ~ 3 doorlopende 10-0 nylon hechtingen in de buitenkant van de aorta.
11. Draai de donor nier transplantaat over aan de linkerflank van de ontvanger. herhaalt u de vorige procedure tussen de donor aorta manchet en de achterste muur van de ontvangers aortaotomy
12. Voer een end-to-side anastomose tussen de donor nier-ader en de achterste muur van de ontvangers IVC, met behulp van 4-5 continue 10-0 nylon hechtingen in de binnenkant van het IVC. en dan de voorste wand van de IVC en donateurs renale ader worden afgesloten met een 4 ~ 5 doorlopende hechtingen buiten het IVC.
13. De anastomose van zowel de ader en slagader moet worden afgerond binnen 20 minuten.
14. Spoel het transplantaat met koud zout meerdere keren tijdens anastomose.
15. Verdeel de koepel van de ontvanger blaas, en stoppen met bloeden cauterisatie.
16. Maak een kleine snee in de koepel.
17. Plaats twee hechtingen verblijf van 10-0 nylon aan de donoren kleine blaas patch anastomize met de ontvangers blaas koepel. Elke zijde van de anastomose wordt gehecht met 8 ~ 10 opeenvolgende steken.
18. Sluit de buik in twee lagen met continue 4-0 steriele, synthetische absorbeerbare Vicryl hechtdraad.
19. Geef ontvangende muizen 0,4 ml warm zout tijdens de operatie door intermitterende injectie IV.

Post-operatieve zorg van de ontvanger

1. Na het sluiten van de buik, is een eenmalige intramusculaire injectie van penicilline (500U/10g) toegediend (2).
2. Daarnaast, ontvangers krijgen 0,05 mg / kg intramusculair buprenorfine op dag 0 en dag 1 na de operatie voor de pijn. Na de operatie, ontvangers van een transplantaat te ontvangen water met daarin sulfatrim (100mg/kg) totdat het experiment is terminated.
3. Voor de eerste 24 uur postoperatief muizen worden bewaard in een temperatuur gecontroleerde incubator.
4. Muizen meestal te herstellen van narcose binnen 1 uur na de operatie en krijgen regelmatig voedsel en water ad libitum.
5. Skin hechtingen worden verwijderd twee weken na de operatie.

Ontvanger Nephrectomy

1. Verdoven van de ontvanger 4 ~ 7 dagen na een niertransplantatie hebben ondergaan met 65 mg / kg pentobarbital IP; anesthesie wordt onderhouden door Isofluraan (2-3%).
2. Open de buik via een middellijn incisie.
3. Bedek de darm met een zoutoplossing gedrenkte gaasje en voorzichtig trekken aan de rechterkant.
4. Verwijder het linker nier na ligeren van de linker ureter-, nier-ader en slagader.
5. Sluit de buik in twee lagen met continue 4-0 synthetische absorbeerbare Vicryl hechtdraad.

Volbloed Creatinine Afmetingen

1. Wekelijks naar tweewekelijkse bloedafname van minder dan 0,2 cc is ofwel submandibularly uitgevoerd zonder verdoving of retro-orbitaal onder Isofluraan verdoving.
2. Kwantitatieve volbloed creatinine niveaus worden bepaald met behulp van een I-Stat Portable Clinical Analyzer (Heska Corp, Fort Collins, CO).
3. Conventionele eenheden (mg / dl) worden geconverteerd naar SI-eenheden van de micromol / L door vermenigvuldiging van de conventionele units van 88,4.

Discussion

Wij hebben ongeveer 1200 gevallen van nier-transplantatie in muizen met een technisch succespercentage van> 90%. In vergelijking met harttransplantatie, het succes van niertransplantatie is meestal laag. Toch heeft ons laboratorium vastgehouden aan een hoog slagingspercentage (> 90%) van de niertransplantatie. De belangrijkste punten voor succes zijn reperfusie verwondingen aan zowel de donor nier en ontvangers, en bloeden en trombose tijdens de gehele procedure en post-operatief te minimaliseren. De volgende factoren kunnen het meest belangrijk: (a) bloeden in de ontvanger te verminderen tijdens de operatie zo veel mogelijk door een zorgvuldige en zachte werking, (b) te minimaliseren warm ischemisch en cross-klem momenten tijdens donor nier voorbereiding en de ontvanger transplantatie; (c) gebruik van een kleine donor blaas patch tot necrose, onvoldoende bloedtoevoer en de blaas lekkage na de operatie te voorkomen; (d) vertraging nefrectomie van de inheemse nier tot 4 ~ 7 dagen na de transplantatie om de getransplanteerde nier te kunnen functioneren na een operatie te herstellen; (e ) uit te voeren anastomosen (tussen de donor aorta manchet en de voorste muur en tussen de donor aorta manchet en de achterste wand van de aorta van de ontvanger) buiten de aorta om de incidentie van trombose te verminderen; (f) ontvangende muizen warm te houden voor in ieder geval voor 24 uur na de ingreep, (g) antibiotica geven aan de ontvangende muizen postoperatief om mogelijke infecties te voorkomen.

In dit protocol, we gebruiken in plaats van 10-0 11-0 hechtdraad, zonder invloed zijn op overleving tarief. Hoewel de 11-0 hechtdraad is ideaal en gebruikt in vele transplantatie laboratoria, we voelen dat 10-0 hechtdraad is voldoende voor gebruik in niertransplantatie zolang de hierboven beschreven factoren goed onder controle zijn.

Het verwijderen van de resterende inheemse nier is onontbeerlijk, zodat daling van de nier transplantaat functie kan worden gecontroleerd door metingen van de serumcreatinine. Alle nier transplantaat ontvangers ondergaan nefrectomie van de linker nier inheemse tussen 4 en 7 dagen na niertransplantatie. Nefrectomie wordt niet uitgevoerd op het moment van niertransplantatie, omdat de ontvangers karakteristiek lijden onder een slechte gezondheid of niet overleven als beide procedures worden uitgevoerd op hetzelfde moment. A 4 tot 7 dagen vertraging tussen de procedures maakt het nier transplantaat om te herstellen van ischemie en reperfusie schade voor de inheemse nier wordt verwijderd. Nier transplantaat functie wordt beoordeeld door de dagelijkse examens van de algehele gezondheid van dieren en bloed creatinine niveaus. Ter referentie, een niet-getransplanteerde, normale muis heeft een creatinine niveau van ongeveer 20 micromol / L. Donornier afwijzing wordt vermoed wanneer de ontvanger de muis tekenen van ziekte vertoont en het creatinine niveau verhoogd de buurt van 100 micromol / L op dat moment grafts worden geoogst voor histopathologisch analyses.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
i-STAT	Other	HESKA	Cat 5101
i-STAT Cartridge	Other	HESKA	CAT 5110-CREA
Sulfatrim	Other	Actavis	R02109
Isoflurane	Other	NOVAPLUS	CA-0474
10-0 Suture	Surgery	Sharpoint	AK0100