Biology

测量线虫固体介质的寿命

Published: May 12, 2009 doi: 10.3791/1152

¹Department of Pathology, University of Washington, ²Molecular and Cellular Biology Program, University of Washington

Summary

在这篇文章中，我们提出了一个测量寿命固体培养基上保持线虫用紫外线灭活的细菌性食物的一般协议。

Abstract

老化是一种退化性的过程，特点是逐渐恶化的细胞成分和细胞器造成的死亡率。线虫

Protocol

第1部分：准备线虫生长介质（NGM）板

本节介绍了在寿命实验中使用的固体NGM板的准备。一个基本的寿命实验需要两种类型的板块：NGM的标准板，它含有任何添加剂，并安培/ FUDR板，氨苄青霉素（AMP）和fluorodeoxyuridine（FUDR）添加到了NGM。氨苄青霉素是用来防止外来细菌污染。 FUDR抑制细胞分裂，降低产蛋量，防止种蛋。 FUDR为长寿分析使用，不影响成人的寿命，不再需要转移蠕虫每隔几天以他们分开增长幼虫。板块的这两种类型的种子与E.大肠杆菌 OP50细菌，随后暴露在紫外线中丧生。

准备NGM（见配方和存储说明第5条）和标签的培养皿板。您将需要1 60毫米，每10毫升的NGM的培养皿板。如果你是与先前准备的坚实NGM开始，继续到步骤1.2。如果你是新鲜的蒸压NGM的开始，请跳到步骤1.4。
在30个脉冲微波高，完全融坚实的NGM的。脉冲之间的漩涡媒体建设，以防止压气泡。
将液体NGM在55℃水浴或冷却在板凳上。
一旦NGM达到55 ° C添加33μL的150毫米FUDR和100μL100毫克/ mL氨苄青霉素，每100毫升NGM（安培/ FUDR板）和漩涡混合。无需额外的药物NGM板，直接进行步骤1.5。
使用移液器10毫升NGM的无菌技术，每60毫米培养皿板。避免形成气泡如果可能的话。如果气泡的形式，他们可以使用枪头弹出。
在板凳上保留与上眼睑板允许NGM的巩固和干。如果可能的话，离开板凳上板2天前加入细菌，但如果需要越早板，1天工作。
当天板块之前完成从新鲜的E.连胜的单个菌落干燥，种子液体LB培养LB琼脂上的大肠杆菌OP50细菌。你应该准备每60毫米的钢板至少有1毫升一夜之间OP50文化。
广场OP50文化在37℃摇床，并允许细菌的生长过夜（文化应达到饱和）。
佩莱OP50细菌纺纱在3500克为10分钟。
取出上清和悬浮细菌的90％集中文化10X。
吸取100μL，10倍浓缩OP50文化中心成为凝固NGM板。旋流板轻轻地摊开细菌培养，如果需要的话（理想的细菌应包括中部地区附近的板壁上的NGM）。尽量避免触摸枪头NGM的表面，在介质的表面缺陷允许进入NGM的蠕虫洞穴。
保留过夜板在板凳上，让细菌培养，干燥的固体NGM（通常需要24小时左右）。
干燥后，揭露板表面的紫外线剂量足以阻止细菌的生长。如果您使用的是一个Stratagene公司紫外线Stratalinker 2400：
- 将板Stratalinker删除盖
- 关闭的大门，并开启了Stratalinker
- 按“能源”
- 输入'9999'使用键盘
- 按“开始”
- 约5分钟，板块将暴露在紫外线
与紫外线杀死细菌板可存放在4 ° C的长达1个月倒挂。

第2部分：执行一个定时产蛋获得一个时代同步的动物人口

在本节中，我们产生一个共同的孵化最新的蠕虫病毒的人口。这是通过允许繁殖活跃的成年人躺在一盘鸡蛋规定的时间内，让这些鸡蛋发展。

（可选）约20名年轻的成虫转移到新鲜无FUDR NGM板。离开板在25 ° C，以使蠕虫传播，并通过所有的细菌的食物吃。细菌的食物被消耗掉后，将进入新孵出的蠕虫被捕的dauer阶段的增长。你将开始看到周围的dauer幼虫在一个星期内，取决于你多少蠕虫转移到板最初的。可用于长达1个月的下一步骤的dauer幼虫。
（可选）传输20至30的dauer幼虫没有FUDR新鲜NGM板。在食品的dauer幼虫存在将成为繁殖活跃的成年人，2天之内，并保持生殖活动及此后几天在25 ° C。
将10至15繁殖活跃的成年人没有FUDR新鲜NGM板。这盘被称为定时产蛋（电话）板。
留下电话板在25℃，6个小时，以便吨他蠕虫产卵。
从电话钢板中取出成虫。板可目视检查之前消除成年人的鸡蛋。如果蠕虫没有奠定了足够数量的鸡蛋的电话板可以留下最多的前24小时删除成虫总在25 ° C。
广场电话板在20 ° C，直到鸡蛋孵化的蠕虫已经开发的L4幼虫阶段（这通常需要2天，野生型线虫，但可以采取与发展缓慢的表型的菌株）。

第3部分：对分数的动物的寿命

在本节中，我们按照从第2部分蠕虫人口的年龄同步，直到他们死去。蠕虫保持放大器/ FUDR板，以防止鸡蛋生产和细菌污染，被认为是死时，他们无法应对外部刺激。

L4幼虫转移到种子安培/ FUDR板。对于每一株或条件被测试，这是典型的设立与25-30蠕虫每盘2-3板。图片的C.线虫的生命阶段提供参考（图^1）1 。
广场安培/ FUDR板在20 ° C时24小时。
24小时后，在视觉上评估蠕虫，媒体和细菌。如果下列任何观察，蠕虫传输到新鲜安培/ FUDR板：
- 蠕虫吃掉大部分细菌的食物。早在寿命实验蠕虫将有一个星期，以防止被耗尽的细菌转移1至2次。
- 一个幼虫的大量存在。这通常是一个蠕虫被转移到为青壮年，而不是L4s安培/ FUDR板，能够打下一些鸡蛋，FUDR生效前的迹象。 FUDR将一般的幼虫防止日益充分的成年人，但偶尔有几个会成长为成年人，并成为与实验动物相混淆。
- 直播/细菌滋生。一般来说，放大器和紫外线杀的组合将确保不活的细菌污染的实验，但偶尔会发生。
- 真菌的生长是在媒体上观察到。如果早期发现足够的，真菌的生长通常可以切出使用枪头或锅铲。一旦它的增长要大于一个直径通常是更容易地转移到一个新的板块的蠕虫几毫米。
- 使用的清扫范围，确定每一个蠕虫病毒是否是活着还是死了。
- 轻轻敲击板。该蠕虫病毒是活的，如果它在攻丝移动。
- 如果蠕虫不响应敲击头部区域板块，放大。
- 轻轻拍打蠕虫的铂转移挑头。分数为死的蠕虫病毒通过移动它的头，如果它不响应。
- 死亡的蠕虫可以从板块中删除。
记录日期和蠕虫的数量，还活着的和死的。
返回板块至20 ° C。
重复步骤3.3至3.6每2至3天，直到所有的蠕虫已经死亡。

第4部分：代表性的结果。

一种线虫的寿命实验中产生的原始数据是一个相应的数字还活着，并为每个测试应变死的蠕虫的日期列表。蠕虫每天死亡的人数通常是反转来计算的每一天活着的蠕虫的比例（图2A），作为一种生存曲线（图2B图形绘制;每天定时产蛋被认为是0天）。每个个人在研究蠕虫的寿命可以计算出从每天死亡的蠕虫计数，用来计算菌株间比较平均数和中位数的寿命。每一天活着的蠕虫数量的计数是不能直接使用在寿命分析。固体培养基上保持蠕虫偶尔会“逃离”，或爬上墙壁板或下方的媒体之一。每一天活着的蠕虫的数量可以被用来确定多少蠕虫在整个实验过程中出逃。蠕虫，逃离通常从分析中删除。为基准，典型的中位数为N2 的 C.寿命线虫野生型菌株对紫外线杀死细菌维持在20 ° C是从鸡蛋计算，约25天。

第5部分：解决方案

线虫的生长介质（NGM），100毫升：
结合：
0.3摹	氯化钠
0.25摹	蛋白胨
2摹	洋菜
高压灭菌40分钟，放凉至55℃，然后添加：
100μL，	1个M硫酸镁₄
100μL，	5 mg / mL的胆固醇
100μL，	1中号氯化钙₂
1.625毫升	1.5米KPI pH值6.0
液体NGM的，可立即使用倒板或允许巩固和长期存储在室温

卢里亚肉汤（LB），1L：
10克	BactoTryptone
5克	酵母提取物
10克	氯化钠
10毫升	1米的Tris pH值8.0
1升	去离子水
高压灭菌器，并在室温下储存。

1个M _硫酸镁 300毫升：
73.95摹	_硫酸镁
300毫升	去离子水
高压灭菌器，并在室温下储存。

5 mg / mL的胆固醇，200毫升：
1克	胆固醇
200毫升	100％的乙醇
过滤消毒，并在室温下保存。

1米_氯化钙，500毫升：
27.75摹	_氯化钙
500毫升	去离子水
过滤消毒，并在室温下保存。

1.5米KPI pH值6.0，1L：
结合：
31.4摹	KPI二元
179.6摹	KPI二氢
850毫升	去离子水
加热边搅拌，让KPI溶解到溶液中。 10 N的氢氧化钠调节pH值至6.0。
加入去离子水至1 L。
高压灭菌器，并在室温下储存。

1米三，pH值8.0：
60.57摹	三
400毫升	去离子水
用HCl调节pH至8.0。
加入去离子水至500 ml。
过滤消毒，并在室温下保存。

150毫米Fluorodeoxyuridine（FUDR），10毫升：
0.3693克	FUDR
10毫升	灭菌去离子水
储存在-20 ° C。

100毫克/ mL氨苄青霉素（AMP），10毫升：
1克	氨苄青霉素
10毫升	灭菌去离子水
储存在-20 ° C。

50毫克/毫升羧（CARB），10毫升：
500毫克	羧
10毫升	灭菌去离子水
储存在-20 ° C。

1米异丙基β- D -硫代半乳糖苷（IPTG），10毫升：
2.38摹	经IPTG
10毫升	灭菌去离子水
储存在-20 ° C。

图1 C.明场图像。线虫的生命阶段，包括卵，幼虫的四个阶段（L1 - L4），和成人。所有面板显示除右下角，这显示了一个成年男性（木（1988年）的图像）雌雄同体。

从A C.代表性的结果图2。 线虫的寿命实验比较应变包含在DAF - 2基因突变的野生型菌株N2 。（A）表显示收集的数据，包括天数，因为蠕虫是鸡蛋，每天观察死亡蠕虫数，和原始样品的剩余百分比活着的每一天（从死虫的日常计数计算）。（二）生存曲线对应的寿命（一）提供的数据。

脂褐素的代表比较年轻人与老年人之间的 成年人C.图 3。线虫。明场图像显示在左侧通道的DAPI荧光图像的权利。前面板显示，4天的老蠕虫和底部面板显示了11天的老蠕虫（从鸡蛋衡量）。

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Discussion

长寿的遗传控制已被广泛研究，在 C 线虫，主要是由于与寿命可确定的易用性和快速性。在这篇文章中讨论的协议描述为获得重现生命跨度的数据，在 C的基本框架也可以应用于线虫和relatednematode物种。做一些简单的改动，这些程序可适应各种条件下的寿命来衡量。在这里，我们将讨论几种常见的变化，包括活的细菌，细菌剥夺限制饮食，RNA干扰（RNAi），和无毒品NGM。

也许从本议定书中最常见的变异是活的细菌的蠕虫维护。这可以通过做一些小的改动。首先，改变播种板块与细菌（步骤1.7至1.13）的过程。 OP50文化日益饱和，增长到日志中期阶段和吸液管200微升到板直接从液体培养。让细菌成长起来的板块，在夜间和省略暴露在紫外线。氨苄青霉素也应排除与FUDR板。使用活菌的一个优点是，蠕虫不经常被转移到新的板块，由于细菌的食物是活着的和不断增长的的。活细菌的食物的缺点是，OP50是病原为 C。 线虫^。3蠕虫生长在活的细菌有一个比紫外线杀死细菌^，3可能的寿命与衰老相关的表型面膜生长的蠕虫生活跨度较短。活的细菌寿命中位数是大约20天。

通过RNAi基因敲除下来是很容易做到在 C通过修改自己的细菌的食物，使其产生相应的被撞倒的基因的双链RNA的线虫。两个RNA干扰细菌库，覆盖超过90％的开放读码框架中的C.线虫的基因组^。4-9利用RNAi的寿命范围内，与利益的RNAi克隆取代OP50细菌和遵循在上段测量活的细菌寿命中讨论了修改。的RNAi库使用基于质粒表达系统。质粒是选择使用一个羧阻力卡带和双链RNA的表达，是由异丙基β- D -硫代半乳糖苷（IPTG）诱导。羧和IPTG都需要在NGM板。修改步骤1.4板两种类型，每100毫升NGM加入100μL1 M IPTG和50μL的50毫克/毫升羧。氨苄青霉素并不需要被添加到两种类型的板块，因为羧履行同样的作用。

限制饮食是跨越进化分歧的物种为减缓老化研究最广泛的干预。在 C 线虫，固体培养基上跨度最大生命延长时观察细菌的食物来源是在成年后完全删除，限制饮食的一种形式被称为细菌^{剥夺（BD），9，10，}要测量的BD中寿命，使两处修改上述协议。首先，准备一个第三类板块。这些板块应该是相同的，除了细菌的食物来源缺乏的Amp / FUDR板。二，修改第3部分包括一个步骤3.2和3.3的步骤之间的额外步骤。在成年期的第4天（4天后转移的L4幼虫安培/ FUDR）转让屋宇署蠕虫安培/ FUDR板缺乏细菌。这种形式限制饮食相关的并发症之一是蠕虫逃离“的倾向。蠕虫在没有食物的情况下不会留板中心附近，反而会增加他们的探索领域，在寻找食物。因此，较大部分的蠕虫会爬板和变干的墙壁。我们经常看到的50％至70％的动物逃离后，被转移到BD板。为了解决这个问题，开始与许多蠕虫的3倍，为了有一个显着的板块飞行后的剩余数量。屋宇署也可以结合现场没有额外的修改，或与一个额外的修饰与RNAi的细菌的食物。 BD与RNA干扰必须增加一个额外的抗生素板块无细菌，防止细菌转移与成长，并提供不必要的食物来源的蠕虫。有两个例子是四环素和卡那霉素，其中之一可以被添加到没有在步骤1.4中的细菌的食物FUDR板。屋宇署也可以开始，早在2天的成年或迟到14天的成年，寿命没有显^着影响。10

最后的修改，我们将讨论测量寿命NGM的板，没有额外的药物（如氨苄青霉素或FUDR）。这是可以实现的根本不添加药物的NGM在第4步和第3部分中添加一个额外的步骤。没有FUDR蠕虫将继续产卵和生产幼虫。所有实验蠕虫在其生殖期（约成年的第一周）将已被转移到新鲜的板，每2天分开，他们的后代。

男性很少发生，主要是雌雄同体线虫。的寿命通常只测量雌雄同体，但男性也可用于测量。有两方面的挑战，与男三线虫。首先是获取大量的雄性蠕虫，为雌雄同体，自体受精产生的雄性后代的很小一部分（0.1％）。一旦含有雄性蠕虫是一个^人口达到11，男/雌雄同体交配产生男性数量约等于只要蠕虫的雌雄同体是保持食物的^存在。男12只股票， 可从网上订购线虫遗传学中心或通过目测筛选产生自体受精雌雄同体的创始男性产生。第二个挑战是男性的清除行为。，无论是食物或潜在配偶（雌雄同体）的情况下，男性蠕虫进入搜索的行为模式，涉及^广泛的运动。，13时平板上保持这种行为的结果，很大一部分的逃离板壁上的蠕虫和desiccating 。一般的方法处理这个困难仅仅是开始后，大部分已经逃离，大量保持足够的男性。

除了寿命，一个常见的年龄相关的表型是脂褐质的积累。脂褐素是复杂的细胞废物，不能退化，积聚在细胞随着年龄的增长，作为一种生物标志物在C老化使用线虫 ^，14，15脂褐素荧光和可以很容易地在 C的可视化线虫使用的DAPI荧光显微镜通道（图3）。脂褐素的积累，可以在直接在NGM板寿命取得的蠕虫可视化，从而使寿命的同时，进行了有益的二次表型的集合。

除了寿命，本文中所描述的协议也可以被用来在 C得分表型年龄相关麻痹进展线虫模型proteotoxicity疾病¹⁶当一个蠕虫病毒会瘫痪，无法抓取整个板块，但仍然可以将其头部。蠕虫是取得作为瘫痪，如果失败了移动板窃听或刺激与铂转移挑相对的NGM，但移动它的头。死亡通常的蠕虫，保留的麻痹得分（瘫痪或瘫痪），他们在最近的现场观察。更重要的是，即使野生C 型线虫瘫痪年事已高。出于这个原因瘫痪通常蠕虫大约20天以上，超越了这一点，取得变得很困难，区分正常老化和瘫痪的proteotoxicity疾病进展引起引起的瘫痪。

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Acknowledgments

这项工作是支持老年学奖和美国国立卫生研究院资助1R01AG031108 - 01 MKGS是由美国国立卫生研究院培训资助P30AG013280支持格伦/ AFAR突破。 Mk为中老年埃利森医学基金会新学者。

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Agar	Reagent	Fisher Scientific	DF0145-17-0 (214530)
Ampicillin	Reagent	MidSci	0339
BactoTryptone	Reagent	Fisher Scientific	DF0123-17-3 (211705)
BactoPeptone	Reagent	Fisher Scientific	DF0118-17-0 (211677)
CaCl₂	Reagent	Fisher Scientific	NC9699248 (1332-01)
Carbenicillin	Reagent	Gold Biotechnology	C0109
Cholesterol	Reagent	Sigma-Aldrich	C75209
Fluorodeoxyuridine (FUDR)	Reagent	Sigma-Aldrich	F0503
Isopropyl β-d-Thiogalactopyranoside (IPTG)	Reagent	Gold Biotechnology	I2481C5
KPi Dibasic	Reagent	Fisher Scientific	5087862 (3252-01)
KPi Monobasic	Reagent	Fisher Scientific	5087861 (3246-01)
MgSO₄	Reagent	Fisher Scientific	NC9561800 (2500-01)
NaCl	Reagent	Fisher Scientific	S251
Tris	Reagent	Sigma-Aldrich	T1503
Yeast Extract	Reagent	Fisher Scientific	DF0886-17-0 (288620)