Summary
In dit artikel geven we een algemeen protocol voor het meten van de levensduur van nematoden gehouden op vaste media met UV-gedode bacteriën voedsel.
Abstract
Veroudering is een degeneratieve proces wordt gekenmerkt door een progressieve verslechtering van de cellulaire componenten en organellen resulterend in sterfte. De nematode
Protocol
Deel 1: Bereid nematode groei media (NGM) platen
Deze paragraaf beschrijft de bereiding van het vaste NGM platen voor gebruik in de levensduur experiment. Een basis levensduur experiment zijn twee types van platen: standaard NGM platen, die geen additieven, en Amp / FUDR platen, die zowel ampicilline (Amp) en fluorodeoxyuridine (FUDR) toegevoegd aan de NGM hebben bevatten. Ampicilline wordt gebruikt om buitenlandse bacteriële besmetting te voorkomen. FUDR remt de celdeling, vermindert de productie van eieren, en voorkomt dat eieren van uitkomen. Het gebruik van FUDR voor een lange levensduur analyse heeft geen invloed op volwassen levensduur en verwijdert de noodzaak om de wormen overdragen om de paar dagen om ze te scheiden van groeiende larve. Beide types van platen zijn bezaaid met E. coli OP50 bacteriën, die vervolgens wordt gedood door blootstelling aan UV.
- Bereid NGM (zie hoofdstuk 5 voor recept en opslag noten) en label petri platen. U moet een 60 mm petri plaat per 10 ml NGM. Als je begint met de eerder bereid solide NGM, blijven 1,2 stap. Als u begint met vers geautoclaveerd NGM, ga dan naar stap 1.4.
- Volledig smelten solide NGM door de magnetron op hoog in de 30 seconden pulsen. Swirl media tussen de pulsen te druk gasbellen te voorkomen dat de opbouw.
- Plaats vloeistof NGM in 55 ° C water bad of op de bank om af te koelen.
- Zodra NGM bereikt 55 ° C toe te voegen 33 pi van 150 mm FUDR en 100 pi van 100 mg / ml ampicilline per 100 ml NGM (voor Amp / FUDR platen) en zwenk om te mengen. Voor NGM platen zonder extra medicijnen gaan rechtstreeks naar 1,5 stap.
- Met behulp van steriele techniek, pipet 10 mL NGM in elkaar 60 mm petri-plaat. Vermijd de vorming van luchtbellen indien mogelijk. Als luchtbellen vormen wel, kunnen ze worden geknald met behulp van een pipet tip.
- Laat platen op de bank met de deksels op om NGM stollen en droog. Indien mogelijk, laat platen bank voor 2 dagen voor het toevoegen van bacteriën, maar 1 dag zal werken als platen zijn eerder nodig zijn.
- Op de dag voordat de platen af te drogen, zaad vloeibaar LB cultuur met een enkele kolonie vanuit een nieuw streak van E. coli bacterie OP50 op LB-agar. U moet zich voorbereiden op zijn minst 1 mL van een overnachting OP50 cultuur per 60 mm plaat.
- Plaats OP50 cultuur in 37 ° C mogelijk maakt shaker en bacteriën om te groeien 's nachts (cultuur moet komen verzadiging).
- Pellet OP50 bacteriën door het draaien bij 3.500 g gedurende 10 minuten.
- Verwijder 90% van de supernatant en resuspendeer bacteriën om zich te concentreren cultuur 10x.
- Pipetteer 100 ul van 10x geconcentreerde OP50 cultuur in het centrum van gestolde NGM platen. Swirl platen voorzichtig te spreiden bacteriën cultuur als dat nodig is (idealiter bacteriën moeten het centrale gebied van de NGM te dekken zonder dat de buurt van de plaat wanden). Probeer te vermijden dat het aanraken van de pipet tip om het oppervlak van de NGM, zoals gebreken in het oppervlak van de media zodat de wormen te graven in de NGM.
- Laat platen op de bank 's nachts, zodat bacteriën cultuur te drogen op de vaste NGM (meestal duurt ongeveer 24 uur).
- Eenmaal droog, bloot het oppervlak van de platen om een UV-dosis voldoende is om de groei van de bacteriën te arresteren. Als u gebruik maakt van een Stratagene UV Stratalinker 2400:
- Plaats platen in de Stratalinker en verwijder de deksels
- Sluit de deur en zet de Stratalinker
- Druk op 'Energie'
- Geef '9999 'met behulp van het toetsenbord
- Druk op 'Start'
- De platen zullen worden blootgesteld aan UV voor ongeveer 5 minuten
- Platen met UV-gedode bacteriën kunnen ondersteboven worden opgeslagen bij 4 ° C gedurende maximaal 1 maand.
Deel 2: Voer een getimede eileg tot een leeftijd-gesynchroniseerde populatie van de dieren te verwerven
In deze paragraaf geven we het genereren van een populatie van wormen met een gemeenschappelijke luik-date is. Dit wordt bereikt door te Reproductief actieve volwassenen om eieren te leggen op een bord voor een bepaalde periode van tijd en waardoor die eieren te ontwikkelen.
- (Optioneel) Breng circa 20 jonge volwassen wormen om een frisse NGM plaat zonder FUDR. Laat platen bij 25 ° C, zodat de wormen te verspreiden en te eten door alle van de bacteriële voedsel. Nadat de bacteriën voedsel is geconsumeerd pas uitgekomen wormen zullen in de groei gearresteerd Dauer podium. Je zult om te Dauer larve zien rond te starten binnen een week, afhankelijk van het aantal wormen u in eerste instantie over te dragen aan de plaat. Dauer larve kan gebruikt worden voor de volgende stappen voor maximaal 1 maand.
- (Optioneel) Transfer 20 tot 30 Dauer larve een nieuwe NGM plaat zonder FUDR. In de aanwezigheid van voedsel Dauer larve zal Reproductief actieve volwassenen worden binnen 2 dagen en blijven voor de voortplanting actief voor een paar dagen daarna bij 25 ° C.
- Overdracht 10-15 Reproductief actieve volwassenen een nieuwe NGM plaat zonder FUDR. Deze plaat wordt aangeduid als de getimede eileg (TEL) plaat.
- Laat de TEL plaat bij 25 ° C gedurende 6 uur, om t makenhij wormen tijd om eieren te leggen.
- Verwijder de volwassen wormen uit TEL plaat. Plaat kunnen visueel worden geïnspecteerd voor eieren voordat u volwassenen. Als de wormen nog niet gelegd een voldoende aantal eieren die de TEL plaat kan worden achtergelaten bij 25 ° C tot een totaal van 24 uur voor het verwijderen van volwassen wormen.
- Plaats TEL plaat bij 20 ° C tot de eieren zijn uitgekomen en de wormen hebben ontwikkeld om de L4 larvale stadium (in het algemeen 2 dagen voor wild-type C. elegans, maar kan langer duren voor de stammen met langzame ontwikkeling fenotypes).
Deel 3: Score dieren voor de levensduur
In deze paragraaf volgen we de leeftijd-gesynchroniseerde bevolking van wormen uit deel 2 tot ze sterven. Wormen zijn bijgehouden op Amp / FUDR platen ei-productie en bacteriële besmetting te voorkomen en worden geacht dood als ze niet reageren op prikkels van buitenaf.
- Overdracht L4 larve tot gezaaid Amp / FUDR platen. Voor iedere stam of conditie worden getest, is het typisch op te zetten 2-3 borden met 25-30 wormen per plaat. Beelden van de C. elegans levensfasen zijn bedoeld voor referentie (Figuur 1) 1.
- Plaats Amp / FUDR platen bij 20 ° C gedurende 24 uur.
- Na 24 uur, visueel te beoordelen wormen, media, en bacteriën. Overdracht wormen in de frisse Amp / FUDR platen als een van de volgende wordt waargenomen:
- Wormen hebben gegeten het grootste deel van de bacteriële voedsel. Vroeg in de levensduur van wormen experiment zal moeten worden overgebracht 1 tot 2 keer een week om de bacteriën te voorkomen dat uitgeput.
- Een groot aantal van de larven aanwezig zijn. Dit is meestal een indicatie dat de wormen werden overgebracht naar de Amp / FUDR platen als jonge volwassenen in plaats van L4S en waren in staat om enkele eieren te leggen voordat de FUDR van kracht werd. De FUDR zal de larven in het algemeen te voorkomen groeien in volle volwassenen, maar af en toe een paar zal uitgroeien tot volwassenen en worden verward met de proefdieren.
- Live / groeiende bacteriën worden waargenomen. In het algemeen zal de combinatie van Amp-en UV-doden ervoor te zorgen dat er geen levende bacteriën het experiment worden besmet, maar af en toe het zich voordoet.
- Schimmelgroei is waargenomen op de media. Als vroeg genoeg bij bent, kan schimmelgroei meestal worden gesneden met behulp van een pipet tip of spatel. Als het eenmaal groeit groter te zijn dan een paar millimeter in diameter is het meestal makkelijker om de wormen te dragen aan een nieuwe plaat.
- Met behulp van de dissectie bereik, bepalen of elke worm is levend of dood.
- Tik voorzichtig de plaat. De worm is levend als het beweegt in reactie op de tikken.
- Als de worm niet reageert op het aanboren van de plaat, zoom in op het hoofd regio.
- Tik voorzichtig de worm het hoofd met platina overdracht te plukken. De score van de worm als dood als het niet reageert door het bewegen van zijn hoofd.
- Dode wormen kunnen worden verwijderd uit de plaat.
- Noteer de datum en het aantal wormen die zijn levend en dood.
- Keer terug platen tot 20 ° C.
- Herhaal stap 3.3 tot 3.6 om de 2 tot 3 dagen totdat alle wormen zijn gestorven.
Deel 4: Representatieve resultaten.
De ruwe gegevens die door een nematode levensduur experiment is een lijst van data met de bijbehorende aantallen wormen die nog in leven en dood voor elk getest stam. Het aantal wormen die sterven op elke dag is meestal omgekeerd om het aandeel van de wormen leven op elke dag (Figuur 2A), die grafisch wordt uitgezet als een survival curve (Figuur 2B te berekenen; de dag van de getimede eileg wordt beschouwd als dag 0 ). De levensduur voor elke individuele worm in de studie kan worden berekend op basis van de telling van de wormen die sterven op elke dag en gebruikt voor het gemiddelde en mediane levensduur te berekenen voor vergelijking tussen de stammen. De telling van het aantal wormen in leven op elke dag wordt niet direct gebruikt in de levensduur analyse. Worms onderhouden op vaste media zal zo nu en 'vluchten', of kruipen of op de muur van de plaat of naar beneden onder de media. Het aantal wormen leven op elke dag gebruikt kan worden om te bepalen hoeveel wormen gevlucht in de loop van het experiment. Wormen die vluchten worden meestal verwijderd uit de analyse. Als benchmark, de typische gemiddelde levensduur van N2, de C. elegans wild-type stam, gehouden op UV-gedode bacteriën bij 20 ° C is ongeveer 25 dagen gemeten vanaf ei.
Deel 5: Oplossingen
| Nematoden Groei Media (NGM), 100 ml: | |
| Te combineren: | |
| 0,3 g | NaCl |
| 0,25 g | Pepton |
| 2 g | Agar-agar |
| Autoclaaf gedurende 40 minuten en laat afkoelen tot 55 ° C, dan toevoegen: | |
| 100 ul | 1 M MgSO 4 |
| 100 ul | 5 mg / ml Cholesterol |
| 100 ul | 1 M CaCl2 |
| 1,625 mL | 1,5 M KPI pH 6,0 |
| Vloeistof NGM kan onmiddellijk worden gebruikt om de platen gieten of de gelegenheid te stollen en opgeslagen op lange termijn bij kamertemperatuur | |
| Luria Broth (LB), 1L: | |
| 10 g | BactoTryptone |
| 5 g | Gist Extract |
| 10 g | NaCl |
| 10 ml | 1 M Tris pH 8,0 |
| Een L | gedeïoniseerd water |
| Autoclaaf en bewaren bij kamertemperatuur. | |
| 1 M MgSO 4, 300 ml: | |
| 73,95 g | MgSO 4 |
| 300 ml | gedeïoniseerd water |
| Autoclaaf en bewaren bij kamertemperatuur. | |
| 5 mg / ml Cholesterol, 200 ml: | |
| 1 g | cholesterol |
| 200 ml | 100% ethanol |
| Filter steriliseer en bewaar bij kamertemperatuur. | |
| 1 M CaCl 2, 500 ml: | |
| 27,75 g | CaCl 2 |
| 500 ml | gedeïoniseerd water |
| Filter steriliseer en bewaar bij kamertemperatuur. | |
| 1,5 M KPI pH 6,0, 1L: | |
| Te combineren: | |
| 31,4 g | KPI dibasisch |
| 179,6 g | KPI monobasisch |
| 850 ml | gedeïoniseerd water |
| Warmte tijdens het mengen, zodat KPI op te lossen in oplossing. Pas de pH op 6.0 met 10 N NaOH. | |
| Voeg gedeïoniseerd water tot 1 L. | |
| Autoclaaf en bewaren bij kamertemperatuur. | |
| 1 M Tris, pH 8,0: | |
| 60,57 g | Tris |
| 400 ml | gedeïoniseerd water |
| Pas de pH op 8.0 met HCl. | |
| Voeg gedeïoniseerd water tot 500 ml. | |
| Filter steriliseer en bewaar bij kamertemperatuur. | |
| 150 mM Fluorodeoxyuridine (FUDR), 10 ml: | |
| 0,3693 g | FUDR |
| 10 ml | steriel gedemineraliseerd water |
| Bewaren bij -20 ° C. | |
| 100 mg / ml ampicilline (Amp), 10 ml: | |
| 1 g | Ampicilline |
| 10 ml | steriel gedemineraliseerd water |
| Bewaren bij -20 ° C. | |
| 50 mg / ml carbenicilline (Carb), 10 ml: | |
| 500 mg | Carbenicilline |
| 10 ml | steriel gedemineraliseerd water |
| Bewaren bij -20 ° C. | |
| 1 M Isopropyl β-D-thiogalactopyranoside (IPTG), 10 ml: | |
| 2,38 g | IPTG |
| 10 ml | steriel gedemineraliseerd water |
| Bewaren bij -20 ° C. | |
Figuur 1. Bright gebied beelden van C. elegans levensfasen, zoals ei, de vier larvale stadia (L1 - L4), en volwassen. Alle panelen tonen hermafrodieten, behalve de lagere-rechts, dat een volwassen man (Afbeelding van Wood (1988)) laat zien.
Figuur 2. Representatieve resultaten van een C. elegans levensduur experiment vergelijken van wild-type stam N2 naar een stam met een mutatie in het daf-2-gen. (A) Een tabel met verzamelde gegevens, waaronder het aantal dagen sinds wormen waren eieren, het aantal dode wormen waargenomen op elke dag, en het percentage van het oorspronkelijke monster nog in leven op elke dag (zoals berekend uit de dagelijkse tellingen van dode wormen) . (B) Survival curves die overeenkomt met de levensduur gegevens in (A).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De genetische controle van de levensduur is uitgebreid onderzocht in C. elegans, grotendeels te danken aan het gemak en de snelheid waarmee levensduur kan worden vastgesteld. Het protocol besproken in dit artikel beschrijft een raamwerk voor het verkrijgen van reproduceerbare levensduur gegevens in C. elegans en kan ook worden toegepast op relatednematode soorten. 2 Door het maken van een aantal eenvoudige aanpassingen van deze procedures kunnen worden aangepast aan de levensduur te meten onder verschillende omstandigheden. Hier bespreken we een aantal gemeenschappelijke varianten, waaronder levende bacteriën, RNA-interferentie (RNAi), dieetbeperking door bacteriële achterstelling, en drugsvrije NGM.
Waarschijnlijk is de meest voorkomende variant van dit protocol is de handhaving van de wormen op levende bacteriën. Dit kan worden bereikt door het maken van een paar kleine wijzigingen. Ten eerste verandert de procedure voor het zaaien van de platen met bacteriën (stappen 1.7 tot 1.13). In plaats van het groeiende OP50 culturen tot verzadiging, groeien tot mid-log-fase en de pipet 200 pi op de platen direct uit de vloeistof cultuur. Laat de bacteriën om op te groeien op de borden 's nachts en blootstelling aan UV-weglaten. Ampicilline moet ook worden uitgesloten van de platen met FUDR. Een voordeel voor het gebruik van levende bacteriën is dat de wormen niet hoeven te zo vaak worden overgedragen aan nieuwe platen, omdat bacteriën voedsel leeft en groeit. Het nadeel van levende bacteriële voedsel is dat OP50 pathogeen is voor de C. elegans. 3 Worms geteeld op levende bacteriën een kortere live-spanwijdte dan wormen gekweekt op UV-gedode bacteriën, 3, die zou kunnen maskeren levensduur van fenotypen geassocieerd met ouder worden. Gemiddelde levensduur van levende bacteriën is ongeveer 20 dagen.
Gen knock down door RNAi is eenvoudig te realiseren in C. elegans door aanpassing van hun bacteriële voedsel, zodat het produceert double-stranded RNA die overeenkomen met het gen te worden gesloopt. Twee RNAi bacteriële bibliotheken beschikbaar zijn dat de dekking meer dan 90% van de open reading frames in de C. elegans genoom. 4-9 te RNAi gebruiken in het kader van de levensduur, vervangt u de OP50 bacteriën met de RNAi-kloon van interesse en volgen de wijzigingen besproken in de vorige paragraaf voor het meten van de levensduur van levende bacteriën. Het RNAi bibliotheken gebruiken een plasmide gebaseerd expressiesysteem. Het plasmide wordt gekozen voor het gebruik van een carbenicilline weerstand cassette en de expressie van het dubbelstrengs RNA wordt geïnduceerd door isopropyl β-d-thiogalactopyranoside (IPTG). Zowel carbenicilline en IPTG moeten worden opgenomen in de NGM platen. Wijzig stap 1.4 door het toevoegen van 100 pi 1 M IPTG en 50 il 50 mg / ml carbenicilline per 100 ml NGM op beide types van platen. Ampicilline hoeft niet te worden toegevoegd aan een type plaat, omdat carbenicilline vervult dezelfde rol.
Calorische restrictie is de meest onderzochte ingreep voor het vertragen van ouder worden in evolutionair uiteenlopende soorten. In C. elegans, een maximale levensduur verlenging op vaste media is waargenomen wanneer de bacteriële bron van voedsel is volledig verwijderd tijdens de volwassenheid, een vorm van calorische restrictie genoemd bacteriële achterstand (BD). 9, 10 tot en levensduur maatregel in het kader van de BD, om twee wijzigingen het bovenstaande protocol. Eerste, bereiden een derde type van plaat. Deze platen moeten identiek zijn aan de Amp / FUDR platen behalve ontbreekt de bacteriële bron van voedsel. Ten tweede, aan te passen deel 3, een extra stap tussen stap 3.2 en stap 3.3 omvatten. Op de 4e dag van de volwassenheid (4 dagen na de overdracht van de L4 larven Amp / FUDR) over te dragen BD wormen Amp / FUDR platen ontbreekt bacteriën. Een complicatie in verband met deze vorm van calorische restrictie is de wormen 'neiging om te vluchten. Bij het ontbreken van voedsel de wormen zullen niet blijven in het midden van de plaat, maar zullen hun gebied van exploratie toenemen op zoek naar voedsel. Als gevolg hiervan zal een groter gedeelte van de wormen kruipen de muren van de plaat en uitdrogen. We zien vaak 50% tot 70% van de dieren vluchten na overschrijving naar BD platen. Om dit probleem op, te beginnen met drie keer zoveel wormen om een aanzienlijk aantal nog op de borden na de vlucht zijn. BD kan ook gecombineerd worden met live bacteriële voedsel zonder extra aanpassingen of met RNAi met een extra wijziging. Voor de BD met RNAi, moet een extra antibioticum worden toegevoegd aan de platen zonder bacteriën om bacteriën overgedragen met de wormen te groeien en het verstrekken van een ongewenste bron van voedsel te voorkomen. Twee voorbeelden zijn tetracycline en kanamycine, die beide kunnen worden toegevoegd aan de FUDR platen zonder bacteriële voedsel tijdens stap 1.4. BD kan ook worden gestart al vanaf 2 dagen van de volwassenheid of zo laat 14 dagen van de volwassenheid, met geen noemenswaardige invloed op de levensduur. 10
De laatste wijziging die we zullen bespreken is het meten van de levensduur van NGM platen zonder extra middelen (bijvoorbeeld ampicilline of FUDR). Dit kan worden bereiktdoor simpelweg niet toevoegen van de drugs om het NGM tijdens stap 4 en het toevoegen van een extra stap in deel 3. Zonder FUDR de wormen zullen blijven leggen eitjes en larven produceren. Tijdens hun reproductieve fase (ongeveer de eerste week van volwassenheid) alle experimentele wormen zullen moeten worden overgedragen aan verse platen om de 2 dagen om ze te scheiden van hun nakomelingen.
C. elegans zijn voornamelijk tweeslachtig met zeldzame voorkomen van mannen. Levensduur is meestal gemeten voor hermafrodieten alleen, maar kan ook gemeten worden voor mannen. Er zijn twee uitdagingen in verband met het werken met mannelijke C. elegans. De eerste is een grote hoeveelheid van mannelijke wormen verwerven, als hermafrodiet zelf-bevruchting produceert een zeer klein deel van de mannelijke nakomelingen (0,1%). 11 Zodra een populatie met mannelijk wormen is bereikt, mannelijk / hermafrodiet paring produceert ongeveer gelijke aantallen mannen en hermafrodieten zo lang als wormen worden gehandhaafd in de aanwezigheid van voedsel. 12 Man voorraden kunnen worden besteld bij de Caenorhabditis Genetics Center of gegenereerd door visueel screening voor het oprichten van mannen uit hermafrodiet zelf-bevruchting. De tweede uitdaging is mannelijk scavenging gedrag. Bij het ontbreken van een van beide voedsel of mogelijke partners (hermafrodieten), mannelijke wormen voer een zoeken gedrag modus die een brede waaier van beweging houdt. 13 Wanneer onderhouden op platen dit gedrag resulteert in een groot deel van de wormen vluchtende de plaat muren en drogen van . De algemene methode voor het omgaan met dit probleem is eenvoudig om te beginnen met genoeg mannetjes die een aanzienlijk aantal te blijven nadat de meeste zijn gevlucht.
Afgezien van de levensduur, een gemeenschappelijke leeftijd-geassocieerde fenotype is lipofuscine accumulatie. Lipofuscine is complexe cellulaire afval dat niet kan worden afgebroken, dat zich opstapelt in cellen met de leeftijd en wordt gebruikt als een biomarker van veroudering in C. elegans. 14, 15 Lipofuscine fluoresceert en kan eenvoudig worden gevisualiseerd in C. elegans het gebruik van de DAPI kanaal van een fluorescentie microscoop (figuur 3). Lipofuscine ophoping kunnen worden gevisualiseerd in wormen worden gescoord voor de levensduur direct op de NGM platen, waardoor verzameling van een bruikbare secundaire fenotype parallel met de levensduur.
In aanvulling op de levensduur, kan het protocol beschreven in dit artikel ook worden gebruikt om fenotypische progressie van leeftijd-geassocieerde verlamming in C. score elegans modellen van proteotoxicity ziekte. 16 Wanneer een worm raakt verlamd wordt het niet in staat te kruipen over de plaat, maar kan nog steeds bewegen zijn kop. Een worm is gescoord als verlamd als het niet ten opzichte van de NGM bewegen in reactie op de plaat te tikken of te porren met een platina-overdracht te plukken, maar zijn hoofd bewegen. Wormen die meestal sterven behouden de verlamming score (verlamd of niet verlamd) dat zij werden gegeven tijdens de meest recente live-observatie. Belangrijk is dat zelfs wild type C. elegans raken verlamd van gevorderde leeftijd. Om deze reden verlamming is meestal niet gescoord voor de wormen die ouder zijn dan ongeveer 20 dagen, voorbij dit punt wordt het moeilijk om onderscheid te maken tussen verlamming veroorzaakt door normale veroudering en verlamming als gevolg van progressie van de ziekte proteotoxicity.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door een Glenn / verre Doorbraken in Gerontologie Award en NIH Grant 1R01AG031108-01 naar MKGS wordt ondersteund door NIH training te verlenen P30AG013280. MK is een Ellison Medical Foundation New Scholar in Aging.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Reagent | Fisher Scientific | DF0145-17-0 (214530) | |
| Ampicillin | Reagent | MidSci | 0339 | |
| BactoTryptone | Reagent | Fisher Scientific | DF0123-17-3 (211705) | |
| BactoPeptone | Reagent | Fisher Scientific | DF0118-17-0 (211677) | |
| CaCl2 | Reagent | Fisher Scientific | NC9699248 (1332-01) | |
| Carbenicillin | Reagent | Gold Biotechnology | C0109 | |
| Cholesterol | Reagent | Sigma-Aldrich | C75209 | |
| Fluorodeoxyuridine (FUDR) | Reagent | Sigma-Aldrich | F0503 | |
| Isopropyl β-d-Thiogalactopyranoside (IPTG) | Reagent | Gold Biotechnology | I2481C5 | |
| KPi Dibasic | Reagent | Fisher Scientific | 5087862 (3252-01) | |
| KPi Monobasic | Reagent | Fisher Scientific | 5087861 (3246-01) | |
| MgSO4 | Reagent | Fisher Scientific | NC9561800 (2500-01) | |
| NaCl | Reagent | Fisher Scientific | S251 | |
| Tris | Reagent | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Yeast Extract | Reagent | Fisher Scientific | DF0886-17-0 (288620) |
References
- Wood, W. B. The Nematode Caenorhabditis elegans. Wood, W. B. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. 1-16 (1988).
- Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. Dietary restriction by bacterial deprivation increases life span in wild-derived nematodes. Exp Gerontol. 43, 130-135 (2008).
- Garigan, D. Genetic analysis of tissue aging in Caenorhabditis elegans: a role for heat-shock factor and bacterial proliferation. Genetics. 161, 1101-1112 (2002).
- Chen, D., Pan, K. Z., Palter, J. E., Kapahi, P. Longevity determined by developmental arrest genes in Caenorhabditis elegans. Aging Cell. 6, 525-523 (2007).
- Curran, S. P., Ruvkun, G. Lifespan regulation by evolutionarily conserved genes essential for viability. PLoS Genet. 3, e56-e56 (2007).
- Dillin, A. Rates of behavior and aging specified by mitochondrial function during development. Science. 298, 2398-2401 (2002).
- Hamilton, B. A systematic RNAi screen for longevity genes in C. elegans. Genes Dev. 19, 1544-1555 (2005).
- Hansen, M., Hsu, A. L., Dillin, A., Kenyon, C. New genes tied to endocrine, metabolic, and dietary regulation of lifespan from a Caenorhabditis elegans genomic RNAi screen. PLoS Genet. 1, 119-128 (2005).
- Lee, S. S. A systematic RNAi screen identifies a critical role for mitochondria in C. elegans longevity. Nat Genet. 33, 40-48 (2003).
- Smith, E. D. Age- and calorie-independent life span extension from dietary restriction by bacterial deprivation in Caenorhabditis elegans. BMC Dev Biol. 8, 49-49 (2008).
- Hodgkin, J., Horvitz, H. R., Brenner, S. Nondisjunction Mutants of the Nematode CAENORHABDITIS ELEGANS. Genetics. 91, 67-94 (1979).
- Emmons, S. W., Sternberg, P. W. C. ELEGANS II. Riddle, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Springs Harbor, NY. (1997).
- Lipton, J., Kleemann, G., Ghosh, R., Lints, R., Emmons, S. W. Mate searching in Caenorhabditis elegans: a genetic model for sex drive in a simple invertebrate. J Neurosci. 24, 7427-7434 (2004).
- Davis, B. O., Anderson, G. L., Dusenbery, D. B. Total luminescence spectroscopy of fluorescence changes during aging in Caenorhabditis elegans. Biochemistry. 21, 4089-4095 (1982).
- Klass, M. R. Aging in the nematode Caenorhabditis elegans: major biological and environmental factors influencing life span. Mech Ageing Dev. 6, 413-429 (1977).
- Steinkraus, K. A. Dietary restriction suppresses proteotoxicity and enhances longevity by an hsf-1-dependent mechanism in Caenorhabditis elegans. Aging Cell. 7, 394-404 (2008).
