Summary
この記事では、UV殺菌細菌食品を固体培地上で維持線虫の寿命を測定するための一般的なプロトコルを提示する。
Abstract
老化は細胞成分と死亡率をもたらす細胞内小器官の進行性の悪化によって特徴付け変性過程です。線虫
Protocol
パート1：準備線虫の増殖培地（NGM）プレート
このセクションでは、寿命の実験のための固体NGMプレートの準備について説明します。アンピシリン（アンプ）とNGMに追加fluorodeoxyuridine（FUDR）の両方を持っていない添加物、およびアンプ/ FUDRプレートが含まれていては標準のNGMプレート、：基本的な寿命の実験では、プレートの2つのタイプが必要です。アンピシリンは、外国の細菌汚染を防ぐために使用されます。 FUDRは、細胞分裂を阻害卵の生産が減少し、孵化から卵を防ぎます。長寿の分析のためのFUDRの使用は、成人の寿命に影響を与えると成長する幼虫からそれらを分離するために数日ごとにワームを転送する必要がなくなりますしていません。プレートの両方のタイプがEでシードされていますその後、紫外線への曝露によって殺されている大腸菌 OP50細菌、。
- NGM（レシピとストレージノート用のセクション5を参照）とラベルのペトリ皿を準備します。あなたは、NGMの10 mLの当たり1 60ミリメートルのペトリ皿が必要になります。以前に調製した固体NGMで開始している場合は、1.2に進みます。あなたが新鮮なオートクレーブNGMで開始している場合は、1.4に進みます。
- 完全に30秒のパルスに高い上に電子レンジで固体NGMを溶かす。構築から加圧ガスの気泡を防ぐために、パルス間の渦巻のメディア。
- 55 ° Cの水浴中または冷却するためにベンチの上に置いて液体NGM。
- 一度NGMは55に達する℃〜150 mMのFUDRの33μLを追加し、100mLのNGM（アンプ/ FUDRプレート用）と渦巻きは100 mg / mLのアンピシリンを100μLミックスする。追加の薬剤を使わずにNGMプレートは1.5に直接進む。
- 各60ミリメートルのペトリ皿に無菌操作、ピペット10mLのNGMを使用。可能であれば気泡を形成することは避けてください。泡はフォームをすれば、それらはピペットチップを使用してポップすることができます。
- NGMが固化し、乾燥させるためにふたでベンチでプレートを残す。可能であれば、細菌を追加する前に2日間ベンチでプレートを残すが、プレートがより早く必要とされる場合は、1日に動作します。
- 当日のプレートはE.の新鮮な縞から単一コロニーを、乾燥、種子の液体LB培地を終了する前にLB寒天培地上で大腸菌 OP50細菌を。あなたは、60 mmのプレートあたり一晩OP50文化の少なくとも1 mLを準備する必要があります。
- 場所OP50 37文化℃のシェーカーと細菌は（文化が飽和状態に達するはずです）一晩増殖することができます。
- 10分3,500 gで回転させてペレットOP50細菌。
- 文化が10倍集中して上清を再懸濁します細菌の90％を削除します。
- 固化NGMプレートの中央に10倍濃縮OP50文化の100μL添加します。優しくスワールプレート、必要に応じて細菌の文化を広げるために（理想的に細菌が板壁の近くに来ることなく、NGMの中心的なエリアをカバーしてください）。メディアの表面に欠陥がNGMに巣穴にワームを可能として、NGMの表面にピペットチップを触れないようにしてみてください。
- 細菌の培養は固体NGM（通常は約24時間かかります）で乾燥させるため一晩ベンチ上でプレートを残す。
- 一度乾燥、細菌の増殖を阻止するのに十分な紫外線量にプレートの表面を露出。あなたは、ストラタジーン社製のUV Stratalinker 2400を使用している場合：
- Stratalinkerにプレートを置き、蓋を取り除く
- ドアを閉めて、Stratalinkerをオンに
- プレス"エネルギー"
- '9999'はキーパッドを使用して入力してください
- プレス"スタート"
- プレートは、約5分間紫外線にさらされる
- UV -死菌したプレートは、° Cまでの1ヶ月間4℃逆さまに保存することができます。
パート2：動物の年齢、同期の人口を獲得するために敷設タイミング卵を実行する
このセクションでは、一般的なハッチ、日付とワームの人口を生成する。これは、生殖アクティブな大人が定義された期間についてはプレート上に卵をできるようにすると、それらの卵を開発することによって実現されます。
- （オプション）FUDRせず、新鮮なNGMプレートに約20の若い成虫を転送します。ワームは、細菌性のすべてを通って伝播し、食べることを可能にするために25℃でプレートにしておきます。細菌の食品が消費された後に孵化したワームは、dauer段階成長停止が入力されます。あなたが最初にプレートに転送する方法多くのワームに応じて、週間以内に周りdauer幼虫を見て開始されます。 Dauerの幼虫は、最大1ヶ月間次のステップに使用することができます。
- FUDRのない新鮮なNGMプレート（任意）転送20〜30 dauer幼虫。食品dauer幼虫の存在下で2日以内に生殖アクティブな大人になると25℃で、その後数日間、生殖アクティブのまま℃に
- FUDRのない新鮮なNGMプレートに10〜15生殖アクティブな大人を転送します。このプレートは、時限の産卵（TEL）プレートと呼ばれます。
- ℃で6時間tを可能にするために25℃TELプレートを残す彼はワーム産卵のために時間を。
- TELプレートから成虫を削除します。プレートは、視覚的に大人を削除する前に、卵の検査を行うことができます。ワームは、卵の十分な数を配置していない場合はTELプレートは、成虫を削除する前に24時間の合計に、最大で25 ° Cで残すことができます。
- 20℃の場所TELプレート° Cの卵が孵化しているとワームはL4幼虫期（これは通常、野生型線虫C. elegansのために2日かかりますが、遅い開発の表現型を有する株のために長い時間がかかることができる）するために開発されるまで。
パート3：寿命のためのスコアの動物
彼らは死ぬまでこのセクションでは、パート2からのワームの年齢同期人口に従ってください。ワームは、卵の生産と細菌汚染を防ぐためにアンプ/ FUDRプレート上で維持され、それらが外部刺激に応答しなかったときに死んだと見なされます。
- シードアンプ/ FUDRプレートにL4幼虫を移す。テスト対象の各菌株または条件の場合は、それがプレート25〜30ワームを2〜3プレートを設定するのが一般的です。 C.の画像虫のライフステージは、基準（図1）のために用意されています1。
- 20位のアンプ/ FUDRプレート℃で24時間。
- 24時間後、視覚的にワーム、メディア、および細菌を評価する。次のいずれかが観察されている場合、新鮮なアンプ/ FUDRプレートにワームを転送します。
- ワームは、細菌性のほとんどを食べている。早期寿命の実験のワームの1〜2回の枯渇から細菌を防ぐために週を転送する必要があります。
- 幼虫のかなりの数が存在する。これは通常、ワームは、若年成人の代わりにL4sとしてアンプ/ FUDRプレートに移され、FUDRが発効する前にいくつかの卵を産むことができたていたことを示しています。 FUDRは、一般的に完全な大人に成長してから幼虫を防止しますが、時折少しは大人に成長すると実験動物と混同になります。
- ライブ/増殖する細菌が観察されています。一般的に、アンプとUV -殺害の組み合わせは生菌は、実験を汚染しないことが保証されますが、時折それが発生します。
- 真菌の増殖は、メディア上に観察される。早期に十分なキャッチした場合、真菌の増殖は通常、ピペットチップやスパチュラを用いて切り取ることができます。一度それは新しいプレートにワームを転送する方が簡単です、直径数ミリメートルより大きくなるように成長する。
- 解剖スコープを使用して、それぞれのワームが生きているのか死んでいるかどうかを決定する。
- 静かにプレートをタップします。それがタップに反応して移動する場合、ワームは生きている。
- ワームは、頭部領域でのプレート、ズームをタップに応答していない場合。
- ゆっくりとプラチナの転送ピックとワームの頭をタップします。それが頭を動かすことによって応答しない場合、死んだとしてワームのスコアを獲得。
- デッドワームは、プレートから除去することができます。
- 生きていると死んでいる日付とワームの数を記録。
- 20℃にプレートを返す
- すべてのワームが死亡するまで繰り返しては、3.3から3.6まで2〜3日おきに繰り返します。
パート4：代表的な結果。
線虫の寿命実験によって生成された生データは、試験した各菌株のための生きていると死んでいるワームの対応する数値と日付のリストです。それぞれの日に死ぬワームの数は通常、生存曲線（図2Bのようにグラフィカルにプロットされている毎日で生きているワームの割合（図2A）を、計算するために反転され、時限産卵の日を0日とみなされます）。研究では個々のワームの寿命は、それぞれの日に死ぬワームの数から計算し、系統間の比較のために平均値と中央値の寿命を計算するために使用することができます。それぞれの日に生きているワームの数のカウントは、寿命の解析に直接使用されません。固体培地上で維持ワームは、時折"逃げる"、またはメディアの下にプレート上下の壁の上のどちらかクロールされます。それぞれの日に生きているワームの数は、どのように多くのワームは、実験の過程を通して逃げたかを判断するために使用することができます。逃げるワームは、通常は分析から削除されます。 N2、Cのベンチマークとして、典型的な中央値の寿命20℃でUV -死菌で維持虫野生型株、° Cは、卵から測定された約25日です。
パート5：ソリューション
| 線虫の増殖培地（NGM）、100mLの： | |
| 組み合わせる： | |
| 0.3グラム | NaClの |
| 0.25グラム | ペプトン |
| 2グラム | 寒天 |
| 40分間オートクレーブし、℃で、[追加]を55に冷ます。 | |
| 100μL | 1 M MgSO 4を |
| 100μL | 5 mg / mLのコレステロール |
| 100μL | 1 M塩化カルシウム2 |
| 1.625 mLの | 1.5 M KPI液pH6.0 |
| 液体NGMは、室温でプレートを注いですぐに使用したり、固化させ、長期的に保存することができます | |
| ルリアブロス（LB）、1L： | |
| 10グラム | リプトン |
| 5グラム | 酵母エキス |
| 10グラム | NaClの |
| 10mLの | 1 MトリスpH8.0 |
| 1 L | 脱イオン水 |
| オートクレーブ、室温で保管。 | |
| 1 M MgSO 4を 、300mLの： | |
| 73.95グラム | MgSO 4を |
| 300 mLの | 脱イオン水 |
| オートクレーブ、室温で保管。 | |
| 5 mg / mLのコレステロール、200mLの： | |
| 1グラム | コレステロール |
| 200 mLの | 100％エタノール |
| 滅菌濾過し、室温で保管してください。 | |
| 1 M CaCl 2を 、500mLの： | |
| 27.75グラム | CaCl 2の |
| 500 mLの | 脱イオン水 |
| 滅菌濾過し、室温で保管してください。 | |
| 1.5 M KPI液pH6.0、1L： | |
| 組み合わせる： | |
| 31.4グラム | KPI二塩基 |
| 179.6グラム | KPI一塩基 |
| 850 mLの | 脱イオン水 |
| 熱KPIは、溶液中に溶解できるように混合しながら。 10 N NaOHでpHを6.0に調整する。 | |
| 1リットルに脱イオン水を追加します。 | |
| オートクレーブ、室温で保管。 | |
| 1 Mトリス、pH 8.0： | |
| 60.57グラム | トリス |
| 400mLの | 脱イオン水 |
| HClでpHを8.0に調整する。 | |
| 500mLの脱イオン水を追加。 | |
| 滅菌濾過し、室温で保管してください。 | |
| 150mMのFluorodeoxyuridine（FUDR）、10 mLの： | |
| 0.3693グラム | FUDR |
| 10mLの | 滅菌脱イオン水 |
| -20℃で保存 | |
| 100 mg / mLのアンピシリン（アンペア）、10 mLの： | |
| 1グラム | アンピシリン |
| 10mLの | 滅菌脱イオン水 |
| -20℃で保存 | |
| 50 mg / mLのカルベニシリン（炭水化物）、10 mLの： | |
| 500mgの | カルベニシリン |
| 10mLの | 滅菌脱イオン水 |
| -20℃で保存 | |
| 1 Mイソプロピルβ- D -チオガラクトピラノシド（IPTG）、10 mLの： | |
| 2.38グラム | IPTG |
| 10mLの | 滅菌脱イオン水 |
| -20℃で保存 | |
図1℃の明視野像は、卵を含む虫のライフステージ、4つの幼虫（L1 - L4）、および成人。すべてのパネルには、成人男性を（ウッド（1988）からイメージ）を示している、右下を除いて雌雄同体を示す。
図2℃から代表的な結果DAF - 2遺伝子の突然変異を含む株に野生型株のN2を比較線虫の寿命実験。ワームは、卵、それぞれの日に観測された死者ワームの数、およびそれぞれの日に生きている残りの元のサンプルの割合（のような死者のワームの1日あたりの数から計算）のころからの日数を含めて、収集したデータを示す（A）表。 （B）の生存率は（）で提供される寿命のデータに対応する曲線。
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Discussion
長寿の遺伝的制御は 、Cで広く研究されている寿命を決定することができる容易さと速さが主な原因虫 、。この記事に記載されているプロトコルは、Cの再現性の寿命のデータを取得するための基本的な枠組みを説明しエレガンスとはrelatednematodeの種にも適用できます。2は 、これらの手順は、さまざまな条件下での寿命を測定するために適合させることができるいくつかの簡単な変更を行うことで。ここでは、RNA干渉（RNAi）、細菌の欠乏による食事制限、および薬物のないNGM、生菌を含むいくつかの一般的なバリエーションを、説明します。
おそらく、このプロトコルの最も一般的なバリエーションは、生菌でワームのメンテナンスです。これは、いくつかのマイナーな変更を加えることによって達成することができます。最初に、細菌（1.13までのステップ1.7）でプレートをシードするための手順を変更。代わりに飽和するOP50の文化を育てると、200μLの培養液から直接プレートに中期対数増殖期とピペットに成長する。細菌は一晩プレート上に成長し、紫外線への曝露を省略することができます。アンピシリンは、FUDRとプレートから除外する必要があります。生菌を使用する利点は、ワームは、細菌の食べ物は生きていると成長しているので、新しい板に頻繁に転送する必要がないことです。ライブ細菌食品の欠点は、OP50は、Cに病原性であることです。 線虫3ワーム生菌で栽培は、潜在的に加齢に伴う寿命の表現型をマスクすることができるUV -死菌、3上に成長ワームより短いライブスパンを持っている。生菌での中央値の寿命は約20日です。
遺伝子のRNAiによるノックダウンは簡単にC言語で実現されますそれはノックダウンされる遺伝子に対応する二本鎖RNAを生成するように、彼らの細菌の食物を変更することにより、 エレガンス 。二つのRNAiの細菌のライブラリはCでのオープンリーディングフレームの90％以上をカバーすること可能です虫のゲノム。4-9寿命のコンテキストでのRNAiを利用するには、興味のRNAiのクローンでOP50細菌を交換し、生菌の寿命を測定するための前の段落で説明した変更に従ってください。のRNAiライブラリーは、プラスミドベースの発現系を使用してください。プラスミドは、イソプロピルβ- D -チオガラクトピラノシド（IPTG）によって誘導されるカルベニシリン耐性カセットと二本鎖RNAの発現を使用するために選択されます。カルベニシリンとIPTGの両方がNGMプレートに含める必要があります。プレートの両方のタイプに100μLの1 M IPTGし、100mLのNGMあたり50μL50 mg / mLのカルベニシリンを添加することにより1.4をステップ変更してください。アンピシリンはカルベニシリンが同じ役割を果たすので、プレートのいずれかのタイプに追加する必要はありません。
食事制限は、進化的に分岐した種間で老化を遅らせるための最も広く研究されている介入である。 C.で虫 、細菌の食料源が完全に成人、細菌の剥奪（BD）と呼ばれる食事制限の形態中に削除されるとき固体培地上での最大寿命の延長が観察される。9、10、BDのコンテキストで寿命を測定するためには、2つの修正を行う上記のプロトコルへ。最初に、プレートの第三のタイプを準備。これらのプレートは、細菌の食料源を欠いている場合を除きアンプ/ FUDRプレートと同一である必要があります。第二に、ステップ3.2およびステップ3.3までの追加のステップを含むように第3部を変更。成人の4日目（4日間アンプ/ FUDRにL4幼虫を転送した後）にアンプ/ FUDRプレートへの転送BDのワームは、細菌を欠く。食事制限のこのフォームに関連付けられている一つの合併症は、逃げるようにワームの傾向です。食べ物がない場合にはワームは、プレートの中央付近に滞在しませんが、食べ物を求めて探査の彼らの領域が増加します。その結果、ワームの大きな部分は、プレートと干からびるの壁をクロールされます。私たちはしばしば動物の50％〜70％がBDの板に転送された後逃亡参照してください。この問題に対処するために、プレートを飛行後に残っているかなりの数を得るために、多くのワームが3倍で始まります。 BDは、1つ追加の修正と追加の変更、またはRNAiを使ってライブ細菌食品と組み合わせることができます。 RNAi実験のBDの場合は、追加の抗生物質は成長していると、不要な食糧源を提供することから、ワームで転送細菌を防ぐために、細菌なしでプレートに添加する必要があります。二つの例は、ステップ1.4の間に細菌性なしFUDRプレートに添加することができるいずれかのうちテトラサイクリンとカナマイシン、です。 BDは、寿命に有意な影響を与えると、2成人の日や成人の14日限り遅くには早くも開始することができます。10
我々が議論するという最終的な変更は、追加の薬剤（例えば、アンピシリンまたはFUDR）なしNGMプレート上の寿命を測定している。これは行うことができます単に手順4の間にNGMに薬物を追加し、第3部で1つの追加手順を追加しないことにより。 FUDRなく、ワームは、卵を産卵し、幼虫の生産継続されます。彼らの繁殖期（成人期の約一週間）の間にすべての実験的なワームは、彼らの子孫からそれらを分離するために2日ごとに新鮮なプレートに転送する必要があります。
C. elegansは 、男性のまれで、主に雌雄同体です。寿命は、通常、雌雄同体のために測定されるだけでなく、男性のために測定することができます。男性C.での作業に関連する二つの課題があります。 エレガンス 。両性自家受精は雄の子孫の非常に小さな割合（0.1％）を生成するとして最初は、男性のワームを大量に取得している。11、男性、ワームが含まれている人口が達成されると、両性具有/オス交尾は男性のほぼ等しい数値を生成し、ワーム限り、雌雄同体は、食物の存在下で維持されています。12匹の雄株は、 線虫遺伝学センターから注文または視覚的に両性具有の自家受精から生産創立男性のためにスクリーニングすることによって生成することができます。第二の課題は、男性の清掃動作です。食品または潜在的な仲間（雌雄同体）のいずれかが存在しない場合に、男性のワームは動きの広い範囲を含む検索行動のモードを入力します。13プレートの壁を逃れてワームの大部分にプレート上にこの動作の結果を維持し、乾燥されると。この困難に対処するための一般的な方法は、ほとんどが避難した後はかなりの数が残っている十分な男性で開始するだけです。
離れて寿命から、一般的な加齢に伴う表現型は、リポフスチンの蓄積です。リポフスチンは、加齢とともに細胞に蓄積し、Cで老化のバイオマーカーとして使用される劣化することができない複雑な細胞の廃棄物です。 虫 。14、15リポフスチンの蛍光を発すると、C言語で簡単に視覚化することができます蛍光顕微鏡（図3）のDAPIのチャネルを使用して線虫 。リポフスチン蓄積は、寿命と並列に有用な二次表現型の収集を可能にする、直接NGMプレート上に寿命のために得点されているワームで視覚化することができます。
寿命に加えて、この資料に記載されているプロトコルはまた、Cの加齢に伴う麻痺の表現型の進行を獲得するために使用することができます。 proteotoxicity病のelegansはモデル16ワームは、それがプレート全体にクロールすることができないとなるが、それでも、その頭を移動することができます麻痺になる。ワームは、それがタップまたはプラチナの転送ピックでつついプレートに対応してNGMに対して移動に失敗した場合など、麻痺スコアされるが、その頭を移動しません。一般的に死ぬワームは、それらが最新のライブ観察中に与えられたと麻痺のスコアを（麻痺または麻痺していない）を保持。重要なことは、さらに野生型C.虫は、高齢で麻痺する。それはproteotoxicity病の進行によって引き起こされる正常な老化と麻痺によって生じる麻痺を区別することが困難になるこのポイントを超えてこのような理由から麻痺は、通常、約20日以上経過したワームには、得点が記録されません。
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Acknowledgments
この作業は、老年学の賞とNIHグラントMKGSへ1R01AG031108 - 01 NIH訓練助成金P30AG013280でサポートされているのグレン/遠くブレークスルーによってサポートされていました。 MKは、高齢化のエリソン医学財団新奨学生です。
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Reagent | Fisher Scientific | DF0145-17-0 (214530) | |
| Ampicillin | Reagent | MidSci | 0339 | |
| BactoTryptone | Reagent | Fisher Scientific | DF0123-17-3 (211705) | |
| BactoPeptone | Reagent | Fisher Scientific | DF0118-17-0 (211677) | |
| CaCl2 | Reagent | Fisher Scientific | NC9699248 (1332-01) | |
| Carbenicillin | Reagent | Gold Biotechnology | C0109 | |
| Cholesterol | Reagent | Sigma-Aldrich | C75209 | |
| Fluorodeoxyuridine (FUDR) | Reagent | Sigma-Aldrich | F0503 | |
| Isopropyl β-d-Thiogalactopyranoside (IPTG) | Reagent | Gold Biotechnology | I2481C5 | |
| KPi Dibasic | Reagent | Fisher Scientific | 5087862 (3252-01) | |
| KPi Monobasic | Reagent | Fisher Scientific | 5087861 (3246-01) | |
| MgSO4 | Reagent | Fisher Scientific | NC9561800 (2500-01) | |
| NaCl | Reagent | Fisher Scientific | S251 | |
| Tris | Reagent | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Yeast Extract | Reagent | Fisher Scientific | DF0886-17-0 (288620) |
References
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