Visualisera Live Drosophila Gliaceller-neuromuskulära förbindelsen med fluorescerande färger

Summary

Vi beskrev strukturella drag hos Glia-neuromuskulära synapser i en roman Inifrån-ut vävnad förberedelse av levande fluglarver med fluorescerande färger med konfokalmikroskopi. Vi märkta lever nervterminaler med fluorescerande primära antikroppar mot HRP och även visualiseras i perisynaptic utrymmet med fluorescerande dextraner.

Abstract

Vårt projekt identifierade GFP märkt gliaceller strukturer på att utveckla larver flyga neuromuskulär synaps. Att titta på utvecklingen av levande gliaceller-nerv-muskel synapser, utvecklade vi en larv vävnad förberedelse som hade drag av levande intakta larver, men hade också goda optiska egenskaper. Det nya preparatet möjliggjorde också tillgång perfusates till synaps. Vi använde fluglarver, nedsänkt dem i konstgjorda hemolymph, och avslappnad deras normala rytmiska kroppen sammandragningar vid avkylning dem. Nästa vi dissekerade bort den bakre delarna av varje djur och med ett trubbigt insekt stift trycks munnen delarna bakåt genom kroppen hålighet. Detta everteras det larvkroppen väggen, som att vända en strumpa inifrån och ut. Vi avslutade dissektion med ultrafina dissektion sax och därmed avslöjade visceral sidan av muskler kroppen väggen. Den gliaceller strukturer på NMJ uttryckt membranet riktade GFP under kontroll av stödjeceller specifika projektansvariga. De postsynaptiska membranet, SSR (Subsynaptic Reticula) i muskeln uttryckt synaptically riktade dsRed. Vi behövde akut etiketten motorn nervterminaler, den tredje delen av synaps. För att göra det vi tillämpade primära antikroppar mot HRP, konjugerade med ett långt rött avger flurophore. För att testa för färgerier diffusionsegenskaper i perisynaptic utrymmet mellan motor nervterminaler och SSR tillämpade vi en lösning av stora Dextran molekyler konjugerat med långt rött avger flurophore och samlade bilder.

Protocol

Del 1: Tissue Förberedelser

1. Vårt mål är en vävnad beredning av fluglarver där nervsystemet är intakt men insidan av kroppen väggen muskeln utsätts för en konstgjord hemolymph, och kan placeras nära ett mikroskop täckglas för bra optik. Med andra ord, en inifrån och ut larver beredning.
   
   Eftersom konventionell vävnad förberedelser innebär skärning, nåla och sträcka ut muskeln kroppen väggen, och ibland tar bort en del av nervsystemet, behövde vi en annan strategi.
   
   Vi ville djuren inifrån och ut för att vi ville få en ordentlig titt på strukturella drag och strukturella förändringar över tid i synapsen, och vi ville behålla nervsystemet intakt. Vi ville också undvika att sträcka vävnaden och aktiverar sträcka receptorer, vilket skulle göra musklerna rycka och förstöra våra bilder.


2. Till att börja med steg djuren. Utfodring third larver och Wandering third larver är stora och lätta att dissekera så vi får visa om W3 larver. Det här djuret är har Tubby fenotyp, och är bred, så det är lätt att Evert.
   
   Vi använde bara larver att vi aktivt såg krypande, inklusive W3 larver.
3. Rengör ytan av en mask med en mycket mjuk pensel i en petriskål med dubbel-destillerat H2O. Rengör larver har bättre optik och rengöring minskar bakterier.
4. Överför djuret till en liten petriskål på ca 3 ml iskall HL-6, och konstgjorda hemolymph. Sätt skålen på is tills djuret står stilla och slappnar (ca 5 minuter).
5. Håll mycket fin spets tång i ena handen och saxar våren i den andra. Jag använder en sax med min dominanta hand. Gör ett litet hål i kroppen väggen med sax för att equlibrate trycket över kroppen väggen.
6. Håll djuret försiktigt med pincett ner på botten av skålen och klipp av den bakre två segment. Dissekera bort inälvor och fett kroppen kommer sannolikt att flytta ut ur kroppen hålighet. Klipp bort denna vävnad också.
7. Håll larverna mot skålens botten med fin pincett. Håll en # 0 insekt stift i (med en trubbig spets) och tryck den mot munnen delar av larver. Tryck mundelar genom kroppen hålighet som du vänder en strumpa inifrån och ut.
8. Inifrån och ut vävnaden kommer att se ut bilden: nedan. Med ultratunn dissekera verktyg, dissekera bort fett kroppen och trachioles från kroppen väggen. Försöker verkligen svårt att inte dra trachioles, eller koppla nervsystemet. Rippa den trachioles kommer att slita hål i kroppen väggen muskeln.
   
   Ta bort så mycket kroppsfett som du kan. Båda dessa strukturer störa den optiska kvaliteten på din vävnad. Du kanske vill hoppa över kaffet innan du gör denna beredning.


9. När du är klar muskeln blir genomskinliga, inte ogenomskinliga eller vitt. Om du lägger den vävnad prep i HL-6 utan glutamat, vid rumstemperatur, kommer det troligt att kontraktet kommer rytmiskt eftersom motorn mönsterritare i CNS arbetar.
   
   Undvik att använda preps med uppenbart kontrakterade eller oregelbundet kontrakterade kropp väggen muskler.
   
   Den intakta ut och in kroppen vägg lätt tenderar att lägga sig i hälften längs med rygg-och ventral mittlinjer, så prep ger en vänster eller höger "hemi-djur" att visualisera.
10. 1,9 Montera vävnaden i antingen en liten volym kommersiella kammare, såsom Warner kammare, eller ett objektsglas med en brygga täckglas arrangemang. Se del 3 för förslag på montering vävnad.

Del 2: Neuronala Bouton märkning med fluorescerande primär antikropp mot HRP.

1. Sätt 50 mikro liter fluorescerande främsta anti-kroppen mot HRP i HL-6 i en droppe på en petriskål. Sänk insidan ut prep kropp väggen i färgen badet. Du kan se neuron plintbeteckningar efter ca 5 minuter, men inkubera i 10-20 minuter, för en komplett och ljus etikett.
2. Skölj färgen av för 10-30 sekunder i HL-6 i rumstemperatur. Icke-bunden färg sköljningar bort snabbt, så att sköljningen behöver inte vara aggressiv.
3. Variera färgen koncentration och inkubationstid efter behov.

Del 3: Perisynaptic utrymme märkning med dextran flurophore konjugat

1. Späd fluorescerande konjugerade dextran färgen utspädd i HL-6. En koncentration som fungerat bra för våra syften var:
2. Om du inte är fråga om tidpunkten för färgen komma in till din extracellulära rummet, sätta en 20 mikro liter droppe färg på en "brygga" täckglas (se del 4) och deponera Prep i färgen badet.

Del 4: Montering av vävnad för visualisering (med konfokalmikroskopi).

Om du inte behöver BEGJUTA din prep (kort observationer) eller om du vill behålla volymen bad HL-6 liten, använd de dubbla överbryggas bild metod

Om du vill BEGJUTA din prep, prova att använda en perfusion kammare. Vi använde en modified avdelningen från Warner Instruments.

Detaljer för båda följa.

Montering prep på en dubbel-bryggad bild.

1. Använd ett mycket rent objektglas. Superlim två kvadratiska, 18mm (# 1.5) täckglas på bilden. Lämna en 2 mm mellan kanterna på täckglas.
2. Låt limmet torka helt, eller kommer det att bilda en konstig film över vattenhaltigt medium runt prep.
3. Placera ut och larverna mellan kanterna på täckglas. Du kan behöva placera prep på diagonalen om larver är stor och din bild förvärv systemet har en begränsad pixel array.
4. Täck vävnad med en # 1,5 täckglas, 18mm (mycket rent). Följ "toppen" täckglas bilden anbringas vävnaden kompletterande underklänningar, med minimal vaselin.
5. Sätt en droppe Cargill anpassade objektiv olja med ett brytningsindex 1,3379 (om du använder HL-6) på ovansidan täckglas och flip denna församling över.
6. Placera vävnaden montering på din mikroskop, olja sidan mot målet, och fokusera dina mål.
   Montering av vävnad i en modifierad perfusion kammare.
7. Limma en 1,5 täckglas för att bilda en våning i RC 20 kammare. Placera vävnad i kammaren enligt RC-20 instruktioner. Använd en bit Nytex nät istället för ett täckglas för att bilda ett tak för kammaren.

Del 5: representativa resultat:

1. Inifrån-ut vävnad förberedelse dissektion sekvens:
   
   W3 larver, tvättade ("Tubby" fenotyp) (5.1.1). W3 larver, bakre 2 dissekerat segment. Du kan se feta kropp trycks ut ur kroppen hålighet av trans-kroppen vägg tryck (pil). Försök att minimera viscerala "utbrott" genom att göra ett litet hål i kroppen väggen 1 minut före dissekering (5.1.2). Det prep med inälvorna dissekerade innan du slår på prep ut och in (5.1.3). Den prep, mestadels everteras med stift (pilen) inne i lumen i prep (5.1.4). Muskeln är nu på utsidan och nagelband är på insidan, med några feta kropp och trachioles bifogas (5.1.5). En helt dissekerade vävnad beredning med nästan allt det fett kroppen och dissekerade trachioles (5.1.6).
   
2. Live märkning med anti-HRP på larver NMJ. En representant W3 larver nerv-muskel synapsen med gliaceller förlängning (inifrån och ut-prep). Motorneuronen Bouton terminaler är försedda med ett primärt anti-kroppen mot HRP (magenta), som är konjugerat till Cy5. Den gliaceller processer är märkta med GFP (grönt).
   
3. Perisynaptic utrymme visualiseras fluorescerande med Alexa 680 dextran i en ut och in prep. Den gliaceller processen (grön) är märkt med membran riktade GFP. Den postsynaptiska SSR på muskeln yta (blå) är märkt med dsRed. Den Alexa dextran (röd) former koncentreras i extracellulära områden. Den dextran färgen bildar donut formade bassänger i perisynaptic utrymmen. Den dextran märkning och dsRed märkt SSR visas i gråskala. Notera flera donut formade färga pooler markera perisynaptic utrymmen (pil).

Discussion

Detta förfarande möjliggör långsiktiga avbildning av levande märkta proteiner och processer cell. In situ vävnaden prep vi beskrivit har ett intakt och fungerande CNS, PNS och reflex kretsar. Denna vävnad prep har fördelar jämfört med vanliga larver protokoll flyga muskler, där larvkroppen väggen muskler sträcks (när den är låst ut). Stretching kan snedvrida synaptiska morfologi och utlösa reflex baserad sammandragningar. Vår ut och in prep var mekaniskt stabilt och hade exceptionellt bra optik som underlättade hög upplösning analys av cellförändringar i realtid. Dessutom inifrån och ut preparatet överlevt upp till en timme och får visualisering av synaptiska förändringar över en lång tid kursen.

Under dissektion, noga med att undvika skador på PNS eller CNS. Undvik också sönder eller att dra i tracheae eftersom detta skadar muskelcellerna. Håll muskler kroppen väggen så avslappnad som möjligt. Chilling HL-6 och vävnaden slappnar musklerna kroppen väggen och minskar trans-kroppen vägg spänning. Kalcium (2mm) i den i den konstgjorda hemolymph är viktigt för hälsan och morfologi av gliaceller.

Imaging måste utföras på stabila, icke-fördragsslutande muskelvävnad. Medan 5 mM Glutamat effektivt blockerar neuralt framkallat muskelsammandragningar kan kalciumflödeshämmaren Nifedipin vara ett bra alternativ. Nifedipin vid 10 mikromolära blockerar den mesta (men inte alla) nerv frammanade muskelkontraktion. Nifedipin block spänningsstyrda kalciumkanaler på muskeln cellmembranet mer effektivt än kanaler i samband med frisättningen av neurotransmittorer, vilket blockerar muskelkontraktion och samtidigt tillåta normal NMJ synaptiska funktion (Morrales et al 1999).

Med det förfarande antikroppen märkning, märkt vi kraftigt den extracellulära kolhydrater rester uttrycks på nervterminaler, som är erkänd av anti-HRP primära antikroppen. Vi fick bra märkning med anti-HRP-antikropp från Jackson Labs, finns pre-konjugerat till en rad olika fluoroforer (Cy5-i våra studier). Denna metod kan anpassas för användning med någon primär antikropp som känner igen ett extracellulärt epitop, till exempel märkning extracellulärmatrix molekyler.

In situ "inside-out" vävnad förberedelse, tillsammans med en ändring av protokoll som används av Stork et al 2008, är användbart för sondering cellulära diffusionsmembran. Fluorescerande dextran färga diffusion kan också vara användbart för timing och visualisering perfusat och droger träder i inter-cellulära utrymmen, till exempel synaptic klyftor.

Med fluorescerande dextran färgämnen, är det viktigt att använda en liten kammare volym perfusion. Om det är för "tjock" en gräns skikt färgämne lösning som täcker den struktur du försöker att bilden kan färglösningen obskyra funktionen av intresse, på grund av brist på kontrast mellan färgämne infunderas utrymmen och omgivande strukturer.

Slutligen, vårt strukturkapital märkning tekniker kräver en hög upplösning bildbehandling system som passar för levande vävnad. Vi använde snurrande skiva konfokala mikroskop (kvorum teknik och Perkin-Elmer system) i samband med Volocity programvara (Improvisation), en lång arbetsdag lång, hög numerisk apertur 63x nedsänkning i vatten-objektiv, och lasrar och filter lämpliga för att visualisera GFP, dsRed och långt rött fluoroforer. För avbildning använde vi anpassade formulerat olja mikroskop mål från Cargill laboratorier för att matcha brytningsindex av den konstgjorda hemolymph, HL-6, i samband med 63x nedsänkning i vatten lins. Utan denna olja var brytningsfel betydande och resulterade i förvrängda bilder. Vår på plats preparatet kan användas tillsammans med andra 3-D bildsystem, såsom API DeltaVision Scanning Restaurering system. Dock måste man för att övervinna de höga nivåer av ljusspridningen från den tjocka, levande vävnad förberedelse.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
HL-6: Artifical Drosophila hemolymph, with 5 mM L-glutamate added, and 2 mM Calcium.	Reagent	N/A	NA	5 mM L-glutamate blocked muscle contractions. We used Molecular grade L-Glutamate (Sigma).2 mM Calcium is close to physiological Calcium levels in natural larval hemolymph.References: Macleod et al 2002 and Macleod 2004
Dextran, Alex Fluor 680; 10,000 MW, anionic, fixable	Reagent	Molecular Probes, Life Technologies	D34680	Use a small volume perfusion chamber to keep the total volume of dye low
Anti-HRP-CY5 conjugate (goat)	Reagent	Jackson ImmunoResearch	123-175-021	Dilute 2.0 mg into 1 ml ddH2O; aliquot into 4 microliter aliquots. Freeze at –20C. Dilute one aliquot into 100 microliters of HL-6
Alexa 647 antibody labeling kit	Reagent	Molecular Probes, Life Technologies	A10475	We prepared a total of 80 micro liters of conjugated primary antibody, and stored as 2 microliter aliquots. We diluted each aliquot into 100 microliter of HL-6 for labeling.
Custom Formulated Objective Oil, refractive index 1.3379	Reagent	Cargill Labs	Custom Formulated
Ultra Fine Forceps	Tool	Fine Science Tools	11252-23 or 11295-20
Spring scissors	Tool	Fine Science Tools	91500-09
Ultra fine clipper scissors	Tool	Fine Science Tools	15200-00
Perfusion Chamber RC 20 Series	Tool	Warner Instruments	64-02222
Spinning Disc confocal	Microscope	Quorum Technologies	Quorum Wave FX	Mounted on a Leica DMI6000 Inverted Microscope