Summary
我们描述的神经胶质细胞神经肌肉突触的结构特点，以一种新颖的由内而外的活飞使用共聚焦显微镜荧光染料的幼虫的组织准备。我们辣根过氧化物酶的荧光抗体标记的活神经元的终端，也可视荧光右旋糖酐perisynaptic空间。
Abstract
我们的项目确定在发展中的幼虫飞神经肌肉突触的绿色荧光蛋白标记的胶质结构。为了看住胶质细胞神经肌肉突触的发展，我们开发了一个幼虫的组织编制了完整的幼虫生活的功能，但也有良好的光学性能。这个新的编制也不允许灌流液进入突触。我们用蝇蛆，沉浸在人工血淋巴，寒心他们放宽了其正常的有节奏的身体收缩。下一步，我们解剖了每个动物的后段，并用钝器昆虫针推通过体腔口部位落后。这外翻幼虫体壁，就像把袜子内而外。我们完成了超细清扫剪刀剥离，从而暴露了体壁肌肉内脏的一面。在NMJ的胶质结构对膜有针对性的绿色荧光蛋白，胶质细胞特异性启动子的控制下。突触后膜，肌肉中的SSR（Subsynaptic Reticula）表示突触针对性DsRed的。我们需要清楚地标记的运动神经元终端突触的第三部分。要做到这一点，我们采用的主要抗体，以辣根过氧化物酶结合到远红外发光flurophore。 perisynaptic空间之间的运动神经元终端和SSR的染料扩散性能测试，我们采用一个大型的葡聚糖分子的共轭远红外发光flurophore和收集到的图像解决方案。
Protocol
第1部分：组织准备
- 我们的目标是组织编制的神经系统是完整的蝇蛆，但体壁肌肉的内表面接触到一个人工血淋巴，可定位接近一个良好的光学显微镜盖玻片。换句话说，里面出幼虫准备。
由于传统的组织筹备工作涉及切割，固定和体壁的肌肉伸展，有时消除神经系统的一部分，我们需要一种不同的方法。
我们希望内而外的动物，因为我们想获得以上时间在突触的结构特点和结构变化的一个很好看，我们希望保持神经系统完好无损。我们也希望，以避免伸展的组织，并激活牵张感受器，这将使肌肉抽搐，破坏我们的形象。 - 对于初学者来说，现阶段的动物。喂第三幼虫和流浪第三幼虫大，易于解剖，所以我们将演示W3的幼虫。这种动物是有短粗的表型，是广泛的，所以容易埃弗特。
我们只用幼虫，我们看到积极地爬行，包括W3的幼虫。 - 蛆表面清洁的双蒸馏水的培养皿中的一个非常柔软的油漆刷。清洁幼虫有较好的光学和清洁减少细菌。
- HL - 6约3毫升冰冷的小培养皿，人工血淋巴转移动物。放在冰盘，直至停止不动的动物，并放宽（约5分钟）。
- 持有一方面和在其他弹簧剪刀很精尖的镊子。我用我的惯用手的剪刀。设为一个小孔，在体壁用剪刀equlibrate横跨体壁的压力。
- 倒在盘底部镊子轻轻地握住动物和切断后两部分。解剖了内脏和体腔脂肪体可能会移动。这个组织还切去。
- 保持幼虫对菜用细镊子底部。按住＃0昆虫针（用钝尖），推动对幼虫的口器。推动通过体腔口部位，像你转动内而外的袜子。
- 出组织内将类似于图：下面。超精细的解剖工具，解剖离体壁脂肪体和trachioles。试一下真的很难不拉的trachioles，或断开的神经系统。翻录trachioles RIP在体壁肌中的漏洞。
删除尽可能多的脂肪体，你可以。这两种结构的破坏您的组织的光学质量。您可能想跳过前这样做准备的咖啡。 - 当你完成的肌肉将半透明，不透明的或白色的。如果你把HL - 6没有谷氨酸的组织准备，在室温下，它可能会合同的节奏，因为在中枢神经系统的运动模式发生器工作。
避免用体壁肌肉明显收缩，或不定期承包PREPS。
容易出完整的体壁内往往折沿背，腹中线的一半，所以准备给左或右的“半动物的”可视化。 - 1.9安装在体积小商会，如华纳室，或与桥接盖玻片安排显微镜玻片上的组织。请参阅安装组织的建议的第3部分。
第2部分：对辣根过氧化物酶的主要的抗体与荧光标记的神经元布顿标签。
- 在培养皿中放入HL - 6 50荧光标记对辣根过氧化物酶的主要反身微升。沉浸在染浴内而外的体壁的准备。您可能会看到大约5分钟后，神经元终端标签，但孵育10-20分钟，一个完整的，明亮的标签，。
- 在室温下，HL - 6冲洗10-30秒染料关闭。非绑定的染料冲洗快，所以冲洗周期需要进取。
- 不同染料浓度和培养时间需要。
第3部分：Perisynaptic右旋糖酐flurophore共轭空间标签
- 稀释荧光标记的葡聚糖染料稀释在HL - 6。 A的浓度，以及工作对我们的目的是：
- 如果您不是对染料的访问到您的外空间的时机，把一个“桥接”盖玻片（见第4部分）20微升染料下降和存款准备在染浴。
第4部分：安装可视化（共聚焦显微镜）组织。
如果您没有需要灌注你的准备（简称意见），或者你想保持洗澡HL - 6的小体积，使用双桥玻片法
如果你想灌注你的准备，尽量使用灌注室。我们用一个莫dified商会从华纳仪器。
为后续的详细信息。
安装双桥的幻灯片上的准备。
- 使用一个非常干净的显微镜幻灯片。两个强力胶平方米，18毫米（1.5）盖玻片上的幻灯片。盖玻片边缘之间留下一个2毫米的差距。
- 让胶水完全干燥，否则它会在你准备的水介质，形成一个奇怪的电影。
- 出盖玻片边缘之间的幼虫内的位置。您可能需要一个对角线上的位置的准备，如果幼虫大您的图像采集系统具有有限的像素阵列。
- 封面＃1.5盖玻片，18毫米（很干净）组织。粘“顶”盖玻片的幻灯片贴有最小的凡士林组织侧翼滑倒，。
- 顶端盖玻片（如果您使用的HL - 6）的1.3379折射率嘉吉公司自订的目标油价下降和翻转本次大会。
- 位置显微镜，油面朝着目标的组织大会，并集中你的目标。
安装在灌注腔组织。 - 胶水1.5盖玻片，形成了在RC 20室的地板。在商会组织的地位，每RC - 20指令。使用一块耐特网格，而不是一个盖玻片形成室的屋顶。
第5部分：代表性的成果：
- 由内而外的组织准备清扫序列 ：
W3的幼虫，洗净（“桶状”的表型）（5.1.1）。 W3的幼虫，后2段解剖。你可以看到肥胖的身躯推反体壁的压力（箭头）的体腔。尽量减少内脏“喷发”，通过了一个小洞，在体壁夹层前1分钟（5.1.2）。准备与内脏解剖之前，内而外的准备（5.1.3）。预习，大多外翻，针管腔内的预习（5.1.4）（箭头）。肌肉是现在在外面的角质层内，与一些脂肪体和连接（5.1.5）trachioles。完全解剖一个与几乎所有的脂肪体和trachioles解剖（5.1.6）的组织准备。
- 活动标签使用抗- HRP在幼虫NMJ。一个代表W3的幼虫神经肌肉突触与神经胶质延伸（内而外的预习）。运动神经元布顿终端与主要反身对HRP（洋红色），这是结合Cy5的标记。胶质进程标记GFP（绿色）。
- 荧光Perisynaptic空间可视化与Alexa的680葡聚糖在里面了准备。膜有针对性的GFP标记的胶质过程（绿色）。肌肉表面的突触后的SSR（蓝色）与DsRed的标记。 Alexa的右旋糖酐（红色）的形式集中在细胞外的地区。葡聚糖染料形式在perisynaptic空间甜甜圈形池。葡聚糖标签和DsRed的标记的SSR以灰度显示。请注意多个甜甜圈形染料池，突出perisynaptic空间（箭头）。
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Discussion
此过程允许长期住标记的蛋白和细胞进程的成像。 原位组织准备，我们描述了一个完整的和运作的中枢神经系统，百佳和反射电路。该组织准备已超过标准的幼虫蝇肌肉协议，幼虫体壁的肌肉被拉伸（当它被固定）优势。拉伸可以扭曲突触形态和触发反射的基础收缩。我们出预习内机械性能稳定，并且有特别好的光学，促进细胞的变化实时高分辨率分析。此外里出来准备存活一个小时，并允许在一个较长的时间过程的可视化的突触变化。
在清扫过程中，照顾，以避免损害PNS或CNS。此外，还要避免撕裂或拉，因为这损害的气管肌肉细胞。保持身体壁肌肉尽量放松。冷的HL - 6和组织的体壁肌肉放松和减少跨体壁张力。 （2MM）在人工血淋巴中的钙是至关重要的健康和神经胶质细胞的形态。
成像稳定，非承包肌肉组织必须执行。虽然5毫米谷氨酸有效阻止神经诱发的肌肉收缩，钙通道阻滞剂硝苯地平可能是一种有用的选择。硝苯地平在10微摩尔块的大多数（但不是全部）神经引起肌肉收缩。硝苯地平块肌细胞膜比与神经递质的释放相关渠道，更有效地的电压门控钙离子通道，从而阻止肌肉收缩，同时允许正常NMJ突触功能（Morrales等1999）。
使用抗体的标签过程，我们强劲标记的神经终端，这是公认的抗HRP抗体表达外碳水化合物残留。我们获得优秀的标签，使用从杰克逊实验室，可预先共轭的抗HRP抗体的荧光团（Cy5的，在我们的研究）的各种。这种方法可能适用于任何外的抗原表位，例如标记细胞外基质分子的主要抗体，承认使用。
原位 “内向外”的组织准备，再加上2008年鹳等所使用的协议的修改，是用于探测细胞的扩散障碍。荧光葡聚糖染料扩散，也可能是灌流液和药物进入细胞间的空间，如突触裂，进入时机和可视化。
随着葡聚糖荧光染料，关键是使用体积小，灌注室。如果有太“厚”的染料覆盖结构，寻求形象解决方案的边界层，染料溶液可能掩盖利益的功能，因为缺乏染料注入空间和周围结构之间的对比。
最后，我们的结构标签的技术需要一个高分辨率成像系统合适的活组织。我们使用了纺纱光盘共聚焦显微镜（法定人数技术和在Perkin - Elmer系统）结合Volocity软件（即兴）;工作长度长，高数值孔径63X水浸泡镜片;和适当的可视化的GFP，DsRed和远红光激光器和滤波器荧光团。成像，我们用从嘉吉实验室定制配方显微镜物镜油相匹配的人工血淋巴，HL - 6结合63X水浸泡镜片，折射率。如果没有石油，屈光不正有显着性，并导致扭曲的图像。我们在原位制备与其他3 - D成像系统，如API DeltaVision扫描修复系统，可能被用来。然而，必须采取厚，活组织准备，以克服光散射的高水平。
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Acknowledgments
这个项目是由CIHR和NSERC。我们要感谢创造表达DsRed的标记SSR（北京）和不列颠哥伦比亚大学生物成像设施的飞株倒钩Jusiak。
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| HL-6: Artifical Drosophila hemolymph, with 5 mM L-glutamate added, and 2 mM Calcium. | Reagent | N/A | NA | 5 mM L-glutamate blocked muscle contractions. We used Molecular grade L-Glutamate (Sigma).2 mM Calcium is close to physiological Calcium levels in natural larval hemolymph.References: Macleod et al 2002 and Macleod 2004 |
| Dextran, Alex Fluor 680; 10,000 MW, anionic, fixable | Reagent | Molecular Probes, Life Technologies | D34680 | Use a small volume perfusion chamber to keep the total volume of dye low |
| Anti-HRP-CY5 conjugate (goat) | Reagent | Jackson ImmunoResearch | 123-175-021 | Dilute 2.0 mg into 1 ml ddH2O; aliquot into 4 microliter aliquots. Freeze at –20C. Dilute one aliquot into 100 microliters of HL-6 |
| Alexa 647 antibody labeling kit | Reagent | Molecular Probes, Life Technologies | A10475 | We prepared a total of 80 micro liters of conjugated primary antibody, and stored as 2 microliter aliquots. We diluted each aliquot into 100 microliter of HL-6 for labeling. |
| Custom Formulated Objective Oil, refractive index 1.3379 | Reagent | Cargill Labs | Custom Formulated | |
| Ultra Fine Forceps | Tool | Fine Science Tools | 11252-23 or 11295-20 | |
| Spring scissors | Tool | Fine Science Tools | 91500-09 | |
| Ultra fine clipper scissors | Tool | Fine Science Tools | 15200-00 | |
| Perfusion Chamber RC 20 Series | Tool | Warner Instruments | 64-02222 | |
| Spinning Disc confocal | Microscope | Quorum Technologies | Quorum Wave FX | Mounted on a Leica DMI6000 Inverted Microscope |
References
- Macleod, G. T., Marin, L., Charlton, M., Atwood, H. L. Synaptic Vesicles: Test for a role in presynaptic Calcium regulation. J. Neurosci. 24, 2496-2505 (2004).
- Macleod, G. T., Hegstro, M., Wojtowicz, M., Charlton, M. P., Atwood, H. L. Fast Calcium signals in Drosophila motor neuron terminals. J. Neurophysiology. 88, 2659-2663 (2002).
- Morales, M., Ferrus, A., Martinez-Padron, M. Presynaptic calcium-channel currents in normal and csp mutant Drosophila peptidergic terminals. Eur J Neurosci. 11, 1818-1826 (1999).
- Stork, T., Engelen, D., Krudewig, A., Silies, M., Bainton, R. J., Kla¨mbt, C. Organization and Function of the Blood–Brain Barrier in Drosophila. J. Neurosci. 28, 587-597 (2008).
