住在果蝇眼睛成虫光盘胶质细胞迁移成像

Summary

在这里，我们描述了一个协议，以研究胶质细胞迁移到发展果蝇眼睛使用现场的微观分析与GFP标记的神经胶质细胞配对。

Abstract

脊椎动物和无脊椎动物的生物的神经胶质细胞迁移到最终目标地区，以ensheath，并支持相关的神经元。虽然最近已经取得了进展来形容发展蛹翼（1），研究神经胶质细胞的实时迁移

Protocol

第1部分：预实验设置。

1. 提前一周，队友苍蝇产生幼虫，表达绿色荧光蛋白胶质特异性启动子的控制下。对于我们的实验中，我们的可视化与核本地化，在采用反极性（回购）子（3，4）的神经胶质细胞中的表达序列标签的GFP。
2. 准备盖玻片提前至少一天18毫米的圆形盖玻片浸泡10分钟，在1％多聚- L -赖氨酸的解决方案和空气干燥过夜。
3. 在实验前一天，浸泡70％乙醇过夜的组件在一个清洁Chamlide的磁文化室。
4. 实验当天，准备加入胎牛血清，青霉素，链霉素的解决方案，与胰岛素施耐德的昆虫媒介使用无菌技术，以10毫升培养基。工作浓度：1X小牛血清，100U/ml青霉素链霉素为0.1mg/ml;和0.2毫克/毫升（修改（5））在施耐德的昆虫媒介的胰岛素。
5. 允许的文化室，空气干细胞培养罩。从文化室配制的培养液冲洗洗掉残留的乙醇。

第2部分： 果蝇眼脑复杂的夹层。

1. 选择从一侧飞瓶砸冰的冷冻培养基的培养皿上，几分钟第三龄徘徊幼虫。冷幼虫建议缓慢蠕动身体收缩，便于清扫。
2. 放置在培养基上一个Sylgard涂下解剖镜下菜下降的冰鲜幼虫。
3. 解剖显微镜下，用一双杜蒙罚款钳，牢牢把握幼虫从后部的方式之一，大约三分之一。等待，直到幼虫挤出前结束其口钩。抓住嘴用的镊子完全伸展后的第二对挂钩。解剖幼虫，慢慢拉向相反的方向钳的两对。眼脑的复杂，唾液腺，脂肪组织，和成虫组织一起，将拉远从幼虫体内。不要拉口挂钩太快，否则会撕裂眼脑的复杂。
4. 修剪了唾液腺，脂肪组织，并采用超细剪剪成虫光盘。两半球的大脑和眼睛光盘将被连接到腹神经索和嘴钩。
5. 将18毫米到载玻片盖玻片。留下一个挂过的幻灯片的边缘，为了以后拿起盖玻片盖滑的边缘。新增的培养基下降到18毫米的盖玻片。转移到培养基中，通过抓钳嘴钩眼脑复杂。不要眼脑的复杂，直接掌握产钳或组织将被损坏。
6. 用细清扫剪刀，剪掉口眼脑的复杂和丢弃挂钩。实时成像的重要去除口钩口钩子将继续在文化造成的组织在显微镜移动介质合同。
7. 可视胶质细胞迁移眼内的成虫光盘，仔细切光秆，连接大脑和眼睛光盘的薄组织，并推搡或丢弃的大脑（见图1A）。要可视化的光纤秸秆内神经胶质细胞，离开大脑，视神经秆，眼睛成虫光盘完好无损（见图1E）。
8. 使用镊子拿起盖玻片下方周围组织的利益与永久性记号笔画一个圆圈。这个循环将有助于在显微镜定位在第4部分组织。

第3部分：安装在磁场文化室眼成虫光盘。

1. 使用镊子，抓住挂在盖玻片边缘。盖玻片Chamlide磁腔的底板，在文化，而不会干扰组织。
2. 放置到主体Chamlide室硅胶O型圈。安装底板上的主体。
3. 慢慢加入培养液室。不要太快或组织的利益将受到干扰培养基添加。不要完全填补了腔使气体交换的掩护下。
4. 轻轻将无形Chamlide室顶部覆盖。

第4部分：可视胶质细胞迁移的眼睛光盘。

1. 将共聚焦荧光显微镜舞台上的文化室。找到使用圆盖玻片作为一个低倍率的参考样本。
2. 使用40X镜头聚焦样本。允许组织盖玻片上解决。捕捉图像的眼睛光盘或光纤秸秆每15分钟3-4小时，10。该组织可能会抽搐和迁出的重点。手动对焦组织图像采集前将缓解次是问题。

第5部分：代表结果：

正确执行，我们的协议允许我们收集了一系列眼成虫光盘（图1屋宇署）迁移到视神经柄GFP标记的神经胶质细胞的图像。虽然60分钟的时间内实时成像足够的观察野生型眼成虫光盘内的变化，胶质细胞核的位置，在神经胶质细胞迁移所需的基因突变神经胶质核完全没有退出视神经柄（箭头图1 FH）。

我们有长达240分钟，然后观察培养组织的恶化时期培养的眼脑复合物。经过240分钟的时间点，我们开始观察周围的文化培养眼脑配合物（箭头图2 c）中等GFP阳性细胞。此外，绿色荧光蛋白会积聚在弥漫整个组织建议在组织的完整性崩溃点。

图1：在发展中的野生型和突变体的视觉系统的神经胶质细胞核GFP标记的实时成像。
A，E）的图像，使用微分干涉对比（DIC）的培养野生型和突变眼成虫光盘（ED）的显微镜。在野生型 ，出生于神经胶质细胞和视神经柄（OS）迁移到眼盘。大脑已被删除，以方便扁平化和成像眼成虫光盘。 BD）的荧光显微镜观察野生型的培养眼成虫光盘（一）为0，30和60分钟的时间点发现GFP标记神经胶质细胞核移植眼内盘。

FH）的突变眼脑复杂的荧光显微镜（e）在0，30和60分钟的时间点，展示了在视神经柄（箭头）的GFP标记神经胶质细胞核的拖延。大脑（BR）已经连接到光纤秆茎内的神经胶质细胞，以方便成像。

图2：实时成像GFP标记的胶质膜，在野生型眼成虫光盘。我们已经成功地培养了240分钟的时间眼脑的配合物。组织培养时间超过240分钟，开始打破。培养基周围的眼睛成虫光盘（ED）的，视柄（OS），0（A）和150分（b）和脑叶（BR），300分钟的时间点（C）相比，是免费的GFP阳性细胞，用箭头表示。

Discussion

在这个协议中，我们描述了进入眼内的成虫光盘使用Live显微镜观察神经胶质细胞迁移。在我们的野生型的例子（图1，AD），我们使用核GFP标记神经胶质细胞的运动超过一小时的过程中，观察的眼睛光盘。在胶质细胞迁移的需要在我们的实验室目前正在研究的一个候选基因的突变体，我们观察到，在一个小时内（图1 EH）的拖延胶质细胞的细胞核内的光纤秸秆。我们的策略，可以适应可视化我们感兴趣的基因调节细胞行为的进一步细节。例如，针对膜GFP分子，如mCD8 - GFP，可在神经胶质细胞过程的可视化表达。一个膜结合的绿色荧光蛋白标记的使用，将使我们能够确定，如果在我们的突变体的神经胶质细胞能够延伸到眼碟的细胞过程，如丝状伪足。同样可以表达GFP或标记的微管蛋白与GFP标记的肌动蛋白在发展中的神经胶质细胞，以形象化胶质细胞迁移过程中细胞骨架的变化。此外，检查单GFP标记的突变胶质细胞可以可视化使用活显微镜（6）。这种技术将使我们能够更准确地描述我们感兴趣的基因在调节神经胶质细胞迁移的要求。

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Poly-L-lysine	Reagent	Sigma-Aldrich	P8920
Schneider’s Insect Media	Reagent	Sigma-Aldrich	S0146
Penicillin-Streptomycin	Reagent	Sigma-Aldrich	P4458
Insulin solution from bovine pancreas	Reagent	Sigma-Aldrich	I0516
Chamlide Magnetic chamber	Tool	Live cell Instrument	CM-R-10	35 mm dish type chamber for 18 mm coverslip
Ultra fine clipper scissors	Tool	Fine Science Tools	15200-00
Dumont #5 forceps	Tool	Fine Science Tools	11251-20
Fluorescent microscope	Microscope	Carl Zeiss, Inc.		Any fluorescent imaging system that has the necessary filters and excitation for GFP can be used.