Summary
ここでは、GFPタグ付きのグリア細胞とペアライブ顕微鏡分析を使用して開発をショウジョウバエの眼にグリア細胞の遊走を調べるためのプロトコルについて説明します。
Abstract
脊椎動物と無脊椎動物の生物の両方のグリア細胞はensheathするために、最終的な標的領域への移行と関連する神経細胞をサポートする必要があります。最近の進展は、開発途上蛹の翼（1）、の研究ではグリア細胞のライブマイグレーションを記述するためになされている一方で
Protocol
パート1：プレ実験のセットアップ。
- 事前に一週間は、メイトはグリア特異的プロモーターの制御下にGFPを発現するその幼虫を生成するために飛ぶ。私たちの実験のために我々は、 逆極性（レポ）プロモーター（3,4）を用いてグリア細胞に発現し核局在配列でタグ付けされたGFPを可視化。
- 百分の一晩乾燥したポリ- L -リジン溶液と空気中で10分間18 mmの円形のカバースリップを浸漬することによって、事前に少なくとも一日のスリップをカバーする準備。
- 実験の前日に、70％エタノールで一晩成分を浸漬することによってChamlide磁気培養チャンバーをクリーニング。
- 実験日に、無菌テクニックを使用してシュナイダー昆虫培地10mlにウシ胎児血清、ペニシリン - ストレプトマイシン溶液、およびインスリンを追加することにより、培養液を準備する。使用濃度は以下のとおりです。1Xウシ胎児血清、100U/mlペニシリン、0.1mg/mlストレプトマイシン、およびシュナイダー昆虫培地に0.2 mg / mlのインスリン（（5）から変更）。
- 培養チャンバーは細胞培養のフードで風乾します。準備培養液で洗浄することにより培養チャンバーから残留エタノールを洗い落とす。
パート2： ショウジョウバエの眼と脳の複合体の解剖。
- 数分間氷上でペトリ皿の上に冷やした培地のドロップにハエのバイアルと場所の側から3齢放浪幼虫]を選択します。幼虫をなごむこと解剖を容易にするために蠕動体の収縮を減速することをお勧めします。
- 解剖顕微鏡下Sylgardコートしたディッシュ上で培養液のドロップチルド幼虫を置きます。
- 解剖顕微鏡下で、しっかりと後端からの方法の約3分の1を幼虫を把握するデュモン細かいピンセットを使用してください。幼虫は前端から口のフックを押し出すまで待ちます。フル拡張時に鉗子の2番目のペアと口のフックをつかみます。幼虫を解剖するために、ゆっくりと反対方向に鉗子の2つのペアを引き出します。眼と脳の複合体は、唾液腺、脂肪体、そして成虫組織と一緒に、幼虫の体から離れて引っ張ってくる。口は、彼らが目の脳の複雑な構成ティアオフなるそうでなければ早すぎるとフックを引っ張らないでください。
- 唾液腺、脂肪体、及び超微細クリッパーのはさみを使用して成虫ディスクを切り落とす。脳と目のディスクの二つの半球は、腹側神経索と口のフックに接続されます。
- スライドグラス上に18 mmのカバースリップを配置。後カバーガラスをピックアップするために、スライドの端からぶら下がってカバースリップの片方のエッジを残す。 18 mmのカバースリップ上に培養液のドロップを追加。鉗子で口のフックを把握し、培養培地中に目と脳の複雑なを転送します。鉗子や組織が損傷されると直接眼と脳の複雑なを把握しないでください。
- 細かい解剖鋏を使用して、目と脳の複雑なと廃棄から口のフックを切り落とす。口のフックの除去は、口のフックは、組織の顕微鏡検査中に移動させる培養液中の契約を継続するとして、ライブイメージングのために重要です。
- 目成虫原基内にグリアの移行を可視化するために、注意深く眼茎、脳と目のディスクを接続する細い組織をカットし（図1Aを参照）脳を離れて押したり、廃棄してください。眼茎内グリア細胞を可視化するために、（図1Eを参照）、脳、眼茎、そして目成虫原基はそのままにしておく。
- 鉗子を用いてカバースリップをピックアップし、永久的なマーカーとの利益の組織の周りの下に円を描く。このサークルでは、パート4で顕微鏡のための組織を見つけるのに役立ちます。
第3部：磁気培養チャンバーに目成虫原基をマウント。
- 鉗子を使用して、カバースリップの上盤の端をつかんで。文化の中で組織を乱すことなくChamlide磁気チェンバーの底板にカバースリップを転送します。
- Chamlideチャンバーの本体の上にシリコンO -リングを置きます。底板の上に本体を取り付けます。
- 徐々にチャンバーに培養液を追加します。速すぎるまたは利益の組織が妨害される培養液を追加しないでください。完全にカバーの下にガス交換を可能にするためにチャンバーを埋めるしないでください。
- ゆっくりとChamlideチャンバーの上に目に見えないカバーを置きます。
パート4：目のディスクにグリア細胞の移行の可視化。
- 共焦点または蛍光顕微鏡のステージ上に培養チャンバーを配置。低倍率での参考資料としてカバースリップ上に円を使用してサンプルを探します。
- 40倍レンズを使用してサンプルに焦点を当てる。組織はカバースリップの上に定着することができます。 3-4時間以上、10〜15分目のディスクまたは光茎の画像をキャプチャ。組織は、ピクッと動くとピントが合って移動することがあります。手動で画像をキャプチャする前に組織を中心とする目を軽減します問題があります。
パート5：代表的な結果：
正しく実行される、我々のプロトコルは、私たちが目の成虫原基（図1 BD）に眼茎から移行したGFP -タグ付きグリア細胞の一連の画像を収集することができました。 60分間のライブイメージングは、 野生型の目成虫原基内のグリア細胞核の位置の変化を観察するのに十分でしたが、グリア細胞の遊走に必要な遺伝子の変異体におけるグリアの核は完全に光ファイバー茎（矢印を終了に失敗しました図1 FH）。
我々は、培養組織の劣化を観察する前に240分限り長期間培養眼と脳の複合体を持っている。 240分の時間ポイントに続いて、培養眼脳複合体（図の矢印Aを2 C）を囲む培養培地中でGFP陽性細胞を観察し始める。加えてのGFPで組織の完全性の崩壊を示唆して組織全体にびまん性斑に蓄積されることになります。
図1：開発野生型と変異型視覚システムにおけるGFP -タグ付きグリア細胞核のライブイメージング。
、E）画像を培養し、野生型と変異体目成虫ディスク（ED）の微分干渉コントラスト（DIC）顕微鏡を用いて撮影。 野生型では、グリア細胞はで生まれていると目のディスクに眼茎（OS）から移行する。脳は、平坦化し、目成虫原基のイメージングを容易にするために削除されています。 BD）（A）0、30、および60分の時点ではGFP -タグ付きグリア細胞核が目のディスク内での移行が明らかに野生型培養目成虫原基の蛍光顕微鏡。
の変異体目の脳の複雑なのFH）蛍光顕微鏡（E）0、30℃、および60分の時点では、眼茎内でGFP -タグ付きグリア細胞核（矢印）の失速を示しています。脳（BR）は、茎内グリア細胞のイメージングを容易にするために眼茎に接続されて残されている。
図2： 野生型の目成虫原基におけるGFP -タグ付きグリア膜のライブイメージング。我々は成功し、240分の期間のための目と脳の複合体を培養している。組織培養よりも長い240分では分解し始めます。 300分の時間点（C）に比べて目成虫原基の周囲の培地（ED）、眼茎（OS）、および0（A）と150分（B）で脳の前頭葉には、（BR）、、無料です。矢印で示されているGFP陽性の細胞は、。
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Discussion
このプロトコルでは、ライブ顕微鏡を使用して目成虫原基にグリア細胞の遊走の観察を説明します。私たちの野生型の例（図1 AD）においては、我々は1時間かけ目のディスクにグリア細胞の動きを観察するために核GFPマーカーを使用。現在我々の研究室で研究されてグリア細胞の移行に必要な候補遺伝子の変異では、我々は、1時間の期間（図1 EH）の間に眼茎内のグリア細胞核の失速を観察した。当社の戦略は、興味のある私たちの遺伝子によって制御される細胞挙動のさらなる詳細を可視化するために適応させることができます。例えば、膜は、そのようなmCD8 - GFPとして、GFPの分子を標的と細胞プロセスを可視化するグリア細胞で発現させることができる。私たちの変異体におけるグリア細胞が目のディスクにこのような糸状仮足のような細胞プロセスを拡張することができるかどうか私たちが判断できるようになる膜結合型GFPマーカーを使用してください。同様にGFPでタグ付けされたGFPまたはチューブリンでタグ付けされたアクチンは、グリア細胞の移行時に細胞骨格の変化を視覚化するために開発するグリア細胞で発現させることができる。さらに、単一のGFP標識された変異体グリア細胞の検査は、ライブ顕微鏡（6）を用いて可視化することができる。このテクニックは、私たちはより正確にグリア細胞の遊走を調節する上で興味のある私たちの遺伝子のための要件を記述することができます。
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Acknowledgments
パトリックカフェルティは、カナダの多発性硬化症協会からのポスドクでサポートされています。
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly-L-lysine | Reagent | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| Schneider’s Insect Media | Reagent | Sigma-Aldrich | S0146 | |
| Penicillin-Streptomycin | Reagent | Sigma-Aldrich | P4458 | |
| Insulin solution from bovine pancreas | Reagent | Sigma-Aldrich | I0516 | |
| Chamlide Magnetic chamber | Tool | Live cell Instrument | CM-R-10 | 35 mm dish type chamber for 18 mm coverslip |
| Ultra fine clipper scissors | Tool | Fine Science Tools | 15200-00 | |
| Dumont #5 forceps | Tool | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Fluorescent microscope | Microscope | Carl Zeiss, Inc. | Any fluorescent imaging system that has the necessary filters and excitation for GFP can be used. |
References
- Aigouy, B., Lepelletier, L., Giangrande, A. Glial chain migration requires pioneer cells. J. Neurosci. 28, 11635-11641 (2008).
- Silies, M., Yuva, Y., Engelen, D., Aho, A., Stork, T., Klambt, C. Glial cell migration in the eye disc. J. Neurosci. 27, 13130-13139 (2007).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
- Sepp, K. J., Auld, V. J. Conversion of lacZ enhancer trap lines to GAL4 lines using targeted transposition in Drosophila melanogaster. Genetics. 151, 1093-1101 (1999).
- Gibson, M. C., Patel, A. B., Nagpal, R., Perrimon, N. The emergence of geometric order in proliferating metazoan epitheia. Nature. 442, 1038-1041 (2006).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development. Trends Neurosci. 24, 251-254 (2001).
