Imagens ao vivo da migração das células da glia no Disco Drosophila Eye Imaginal

Summary

Aqui nós descrevemos um protocolo para analisar a migração de células gliais no olho Drosophila desenvolvimento, utilizando análise microscópica ao vivo emparelhado com GFP tag células gliais.

Abstract

Células gliais de ambos os vertebrados e organismos invertebrados devem migrar para regiões de destino final para ensheath e apoio neurônios associados. Embora o progresso recente tem sido feito para descrever a migração de células gliais na ala desenvolvimento pupal (1), estudos de

Protocol

Parte 1: Pré-experimental set-up.

1. Uma semana de antecedência, mate moscas para gerar larva que expressam GFP sob o controle de um promotor glial específico. Para nosso experimento foi visualizada GFP marcado com uma seqüência de localização nuclear expresso em células gliais usando a polaridade invertida (repo) promotor (3, 4).
2. Prepare tampa desliza pelo menos um dia de antecedência por imersão 18 milímetros lamínulas redondas de 10 minutos em 1% de poli-L-lisina solução e ar seco durante a noite.
3. No dia antes do experimento, limpar uma câmara de cultura Chamlide magnética por imersão componentes durante a noite em etanol 70%.
4. No dia do experimento, preparar meios de cultura pela adição de soro fetal bovino, penicilina-estreptomicina solução, e de insulina para 10 ml de meio de insetos Schneider, utilizando técnica asséptica. As concentrações de trabalho são: 1X de soro fetal bovino; 100U/ml penicilina; estreptomicina 0.1mg/ml; insulina e 0,2 mg / ml em meio de insetos Schneider (modificado de (5)).
5. Permitir que a câmara de cultura para ar seco em uma capa de cultura de células. Lavar o etanol residual da câmara de cultura por lavagem com meio de cultura preparado.

Parte 2: Dissecção do complexo Drosophila olho-cérebro.

1. Selecione uma larva do terceiro ínstar vagando do lado de um frasco de voar e coloque em uma gota de meio de cultura refrigeradas em uma placa de Petri sobre gelo por alguns minutos. Refrigeração da larva é recomendada para diminuir as contrações peristálticas do corpo para facilitar a dissecção.
2. Coloque a larva refrigerados em uma gota de meio de cultura em um prato Sylgard revestido sob um microscópio de dissecação.
3. Sob o microscópio de dissecção, use um par de fórceps Dumont multa para agarrar firme a larva aproximadamente um terço do caminho entre a extremidade posterior. Aguarde até que a larva extrudes ganchos sua boca a partir do final anterior. Segure a boca ganchos com um segundo par de fórceps sobre extensão completa. Para dissecar a larva, puxe lentamente os dois pares de fórceps em direções opostas. O complexo olho-cérebro, junto com as glândulas salivares, órgãos, gordura e tecido imaginal, vai puxar para longe do corpo larval. Não puxe a boca ganchos muito rapidamente caso contrário eles vão arrancar do complexo olho-cérebro.
4. Apare as glândulas salivares, corpos gordos, e os discos imaginal usando uma tesoura ultra-fino clipper. Os dois hemisférios do cérebro e olho-discos serão anexados ao cordão nervoso ventral e ganchos boca.
5. Coloque uma lamínula 18 milímetros em uma lâmina de vidro. Deixe uma borda da lamínula pendurado na borda do slide para depois pegar a lamínula. Adicionar uma gota de meio de cultura para a lamínula 18 mm. Transferência do complexo olho-cérebro no meio de cultura, segurando os ganchos na boca com uma pinça. Não entender o complexo olho-cérebro diretamente com a pinça ou o tecido será danificado.
6. Com uma tesoura de dissecção fina, corte na boca ganchos do complexo olho-cérebro e descartar. Remoção dos ganchos boca é importante para geração de imagens ao vivo como os ganchos na boca vai continuar a contrair-se o meio de cultura fazendo com que o tecido se mova durante microscopia.
7. Para visualizar a migração glial no disco imaginal olho, corte cuidadosamente a haste óptica, o tecido fino que liga o cérebro eo disco olho e afasta ou descartar o cérebro (ver figura 1A). Para visualizar glia dentro do talo óptico, deixe o cérebro, talo óptico e disco imaginal olho intacto (ver figura 1E).
8. Pick up a lamela com a pinça e desenhar um círculo em volta do tecido embaixo de interesse com um marcador permanente. Este círculo vai ajudar na localização do tecido para microscopia na Parte 4.

Parte 3: Montagem do disco imaginal olho em uma câmara de cultura magnético.

1. Utilizando uma pinça, segure a ponta pendurada da lamela. Transferir a lamela ao tabuleiro inferior da câmara de Chamlide magnética sem perturbar o tecido em cultura.
2. Coloque o silicone O-ring para o corpo principal da câmara Chamlide. Instale o corpo principal no topo da placa inferior.
3. Lentamente, adicionar meio de cultura para a câmara. Não adicione o meio de cultura muito rapidamente ou o tecido de interesse será perturbado. Não encher completamente a câmara para permitir a troca gasosa sob a tampa.
4. Delicadamente, coloque a tampa invisível no topo da câmara Chamlide.

Parte 4: Visualização de migração de células gliais no disco olho.

1. Coloque a câmara de cultura no palco de um microscópio confocal ou fluorescência. Localize a amostra usando o círculo na lamela como uma referência na baixa ampliação.
2. Foco na amostra usando uma lente de 40x. Permitir que o tecido para resolver sobre a lamínula. Capturar imagens do disco óptico do olho ou perseguir a cada 10-15min mais de 3-4 horas. O tecido pode contorcer-se e mover-se fora de foco. Manualmente focando o tecido antes da captura de imagem irá aliviar ªé problema.

Parte 5: Os resultados representativos:

Realizado corretamente, o nosso protocolo permitiu coletar uma série de imagens de GFP-tagged células gliais que migraram do talo no disco óptico do olho imaginal (Figura 1 BD). Enquanto imagens ao vivo por um período de 60 minutos foi suficiente para observar as mudanças nas posições dos núcleos gliais dentro de um disco de tipo selvagem olho imaginal, núcleos gliais em um mutante de um gene necessário para a migração de células gliais falhou completamente para sair o talo óptica (setas Figura 1 FH).

Temos cultivadas olho-cérebro complexos para períodos de até 240 minutos antes de observar a deterioração do tecido cultivado. Após os 240 minutos de tempo-ponto, começamos a observar as células GFP positivas no meio de cultura em torno cultivadas olho-cérebro complexos (seta Figura 2 C). Em GFP disso irá acumular em pontos difusa em todos os tecidos, sugerindo uma quebra na integridade do tecido.

Figura 1: imagem ao vivo de GFP-tagged núcleos gliais do tipo selvagem e mutante desenvolvimento sistemas visual.
A, E) Imagens tiradas com contraste de interferência diferencial (DIC) de microscopia do tipo selvagem e mutante cultivadas olho-imaginal discos (ED). No tipo selvagem, células gliais nascem e migram da haste óptica (OS) no olho do disco. O cérebro foi removido para facilitar o achatamento e imagem do disco imaginal olho. BD) microscopia de fluorescência do selvagem disco olho tipo cultivado no imaginal (A) em 0, 30 e 60 pontos tempo minucioso revela GFP-tagged núcleos gliais migrar dentro do disco olho.

FH) microscopia de fluorescência do complexo olho-cérebro mutante em (E) em 0, 30 e 60 pontos tempo minucioso demonstra uma estagnação da GFP-tagged núcleos gliais dentro do talo óptico (seta). O cérebro (BR) foi deixado ligado à haste óptica para facilitar a criação de imagens de glia dentro do caule.

Figura 2: imagens ao vivo de GFP-tagged membranas gliais em um disco de tipo selvagem olho imaginal. Conseguimos cultivadas olho-cérebro complexos para 240 minutos períodos. Tecidos cultivados mais de 240 minutos começa a quebrar. O meio de cultura em torno do disco de olho imaginal (ED), perseguir óptica (OS), e lobo cerebral (BR) a 0 (A) e 150 minutos (B), em comparação com o 300 minutos de tempo-ponto (C), é livre da GFP células positivas, indicado por uma seta.

Discussion

Neste protocolo, descrevemos a observação da migração de células gliais no disco imaginal olho através de microscopia ao vivo. No nosso exemplo de tipo selvagem (Figura 1 AD), foi utilizado um marcador GFP nuclear para observar a movimentação das células gliais no disco do olho ao longo de uma hora. Em um mutante de um gene candidato necessários para a migração de células gliais actualmente em estudo no nosso laboratório, observamos um adiamento de núcleos de células gliais no talo óptico durante um período de uma hora (figura 1 EH). Nossa estratégia pode ser adaptado para visualizar detalhes do comportamento celular regulados pelo nosso gene de interesse. Por exemplo, uma membrana alvo molécula de GFP, como mCD8-GFP, pode ser expressa em células gliais para visualizar processos celulares. Uso de um marcador de membrana GFP ligado nos permitirá determinar se as células gliais em nosso mutantes são capazes de estender processos celulares como filopodia no disco olho. Da mesma forma actina marcados com GFP, ou marcadas com GFP tubulina poderia ser expressa na glia desenvolvimento visualize as alterações no citoesqueleto durante a migração de células gliais. Além disso, o exame de um único mutante GFP-rotulados células gliais podem ser visualizados através de microscopia ao vivo (6). Esta técnica nos permitirá descrever com maior precisão a exigência para o nosso gene de interesse em regular a migração de células gliais.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Poly-L-lysine	Reagent	Sigma-Aldrich	P8920
Schneider’s Insect Media	Reagent	Sigma-Aldrich	S0146
Penicillin-Streptomycin	Reagent	Sigma-Aldrich	P4458
Insulin solution from bovine pancreas	Reagent	Sigma-Aldrich	I0516
Chamlide Magnetic chamber	Tool	Live cell Instrument	CM-R-10	35 mm dish type chamber for 18 mm coverslip
Ultra fine clipper scissors	Tool	Fine Science Tools	15200-00
Dumont #5 forceps	Tool	Fine Science Tools	11251-20
Fluorescent microscope	Microscope	Carl Zeiss, Inc.		Any fluorescent imaging system that has the necessary filters and excitation for GFP can be used.