Summary
Nous décrivons ici un protocole visant à étudier la migration des cellules gliales dans le développement de l'œil de drosophile en utilisant l'analyse microscopique direct couplé à la GFP taggés cellules gliales.
Abstract
Les cellules gliales du vertébrés et invertébrés organismes doivent migrer vers des régions cibles finale afin de ensheath et de soutien des neurones associés. Bien que des progrès récents ont été faits pour décrire la migration en direct des cellules gliales dans l'aile de développement nymphal (1), les études de
Protocol
Partie 1: Pré-montage expérimental.
- Une semaine à l'avance, compagnon mouches pour générer larve qui expriment la GFP sous le contrôle d'un promoteur spécifique gliales. Pour notre expérience, nous visualisés GFP taggés avec une séquence de localisation nucléaire exprimé dans les cellules gliales en utilisant les inversions de polarité (repo) promoteur (3, 4).
- Préparer la couverture glisse au moins un jour à l'avance par trempage 18 mm de diamètre glisse couvercle pendant 10 minutes dans 1% de poly-L-lysine solution et l'air sec durant la nuit.
- Le jour avant l'expérience, nettoyer une chambre de culture Chamlide magnétiques par trempage des composants nuit dans l'éthanol à 70%.
- Le jour de l'expérience, de préparer un milieu de culture par l'ajout de sérum bovin fœtal, la pénicilline-streptomycine solution, et l'insuline pour 10 ml de milieu de Schneider insectes en utilisant une technique aseptique. Les concentrations de travail sont: 1X sérum fœtal bovin; 100U/ml pénicilline; streptomycine 0.1mg/ml, et 0,2 mg / ml d'insuline dans le milieu des insectes Schneider (modifié d'après (5)).
- Autoriser la chambre de culture à l'air sec dans une hotte de culture cellulaire. Laver l'éthanol résiduel de la chambre de culture par un rinçage avec un milieu de culture préparé.
Partie 2: Dissection de la drosophile oeil-cerveau complexe.
- Sélectionnez une larve du troisième stade larvaire errance du côté d'un flacon de volée et placer dans une goutte de milieu de culture frais sur une boîte de Pétri sur la glace pendant plusieurs minutes. Chilling la larve est recommandé de ralentir les contractions péristaltiques du corps pour faciliter la dissection.
- Placer la larve réfrigérée dans une goutte de milieu de culture sur un plat recouvert Sylgard sous un microscope de dissection.
- Sous le microscope de dissection, utiliser une paire de pinces fines Dumont de saisir fermement la larve d'environ un tiers de la distance entre l'extrémité postérieure. Attendez jusqu'à ce que la larve extrude ses crochets la bouche de l'extrémité antérieure. Saisir la bouche des crochets avec une deuxième paire de forceps lors de l'extension complète. Pour disséquer la larve, tirez lentement les deux paires de forceps dans des directions opposées. Le complexe oeil-cerveau, avec les glandes salivaires, des corps gras, et les tissus imaginaux, va se détacher du corps larvaire. Ne tirez pas sur la bouche des crochets trop rapidement sinon ils vont déchirer du complexe oeil-cerveau.
- Coupez les glandes salivaires, des corps gras, et les disques imaginaux de l'aide de ciseaux clipper ultra-fines. Les deux hémisphères du cerveau et des yeux disques sera attaché à la corde nerveuse ventrale et crochets bouche.
- Placez un feuillet de 18 mm couvercle sur une lame de verre. Laisser un bord de la lamelle pendait au bord de la diapositive et pouvoir ensuite ramasser les lamelle. Ajouter une goutte de milieu de culture sur le bordereau de 18 mm de couverture. Transfert du complexe oeil-cerveau dans le milieu de culture en saisissant les crochets la bouche avec une pince. Ne pas saisir le complexe de l'œil-cerveau directement avec la pince ou le tissu sera endommagé.
- Avec des ciseaux de dissection fine, couper la bouche des crochets du complexe oeil-cerveau et le jeter. Retrait des crochets bouche est importante pour l'imagerie vivre comme les crochets buccaux continuera de se contracter dans le milieu de culture des tissus provoquant de se déplacer pendant la microscopie.
- Pour visualiser la migration gliales dans le disque imaginal des yeux, couper soigneusement la tige optique, le tissu mince qui relie le cerveau et le disque yeux et pousser ou vous débarrasser du cerveau (voir figure 1A). Pour visualiser la GLIA dans le pédoncule optique, laissez le cerveau, la tige optique, et le disque imaginal des yeux intacts (voir figure 1E).
- Ramassez la lamelle à l'aide de pinces et de dessiner un cercle au-dessous autour du tissu d'intérêt avec un marqueur permanent. Ce cercle vous aideront à localiser les tissus pour la microscopie à la partie 4.
Partie 3: Le montage du disque imaginal des yeux dans une chambre de culture magnétique.
- En utilisant une pince, saisir le bord pendaison de la lamelle. Transférer la lamelle à la plaque de fond de la chambre Chamlide magnétiques sans déranger les tissus en culture.
- Placez le joint torique silicone sur le corps principal de la chambre de Chamlide. Installer le corps principal sur le dessus de la plaque de fond.
- Ajouter lentement milieu de culture à la chambre. Ne pas ajouter le milieu de culture trop vite ou le tissu d'intérêt sera perturbé. Ne pas remplir complètement la chambre de permettre l'échange de gaz sous le couvercle.
- Placez délicatement le couvercle invisible sur le dessus de la chambre de Chamlide.
Partie 4: Visualisation de la migration des cellules gliales dans le disque oculaire.
- Placez la chambre de culture sur la scène d'un microscope confocal ou fluorescence. Localisez l'échantillon en utilisant le cercle sur la lamelle comme une référence sur le faible grossissement.
- Focus sur l'échantillon en utilisant une lentille 40x. Autoriser le tissu à régler sur la lamelle. Capture d'images du disque optique oculaire ou tige tous les 10-15min en 3-4 heures. Le tissu peut se contracter et de sortir de discussion. Mise au point manuelle du tissu avant la capture d'image permettra d'alléger èmeest le problème.
Partie 5: Les résultats représentatifs:
Effectuée correctement, notre protocole nous a permis de collecter une série d'images de la GFP-taggés cellules gliales qui ont migré de la tige optique dans le disque imaginal des yeux (figure 1 BD). Alors que l'imagerie en direct pour une période de 60 minutes était suffisant pour observer les changements dans les positions des noyaux gliales dans un disque de type sauvage oeil imaginale, les noyaux gliales dans un mutant d'un gène nécessaire à la migration des cellules gliales complètement échoué à la sortie de la tige optique (flèches Figure 1 FH).
Nous avons cultivé oeil-cerveau complexes pour des périodes aussi longues que 240 minutes avant d'observer une détérioration du tissu cultivé. Après les 240 minutes de temps-point, nous commençons à observer des cellules GFP-positives dans le milieu de culture environnante cultivée oeil-cerveau complexes (flèche figure 2 C). En outre GFP vont s'accumuler dans les endroits diffuse dans les tissus suggérant une rupture de l'intégrité des tissus.
Figure 1: Imagerie en direct de la GFP-noyaux marqués gliales dans le type sauvage et mutants de développement de systèmes visuels.
A, E) Les images prises à l'aide de contraste d'interférence différentiel (DIC) microscope de type sauvage et mutant cultivé oeil-imaginaux disques (ED). Dans le type sauvage, les cellules gliales sont nés dans et migrent de la tige optique (OS) dans l'œil-disque. Le cerveau a été enlevé pour faciliter l'aplatissement et l'imagerie du disque imaginal des yeux. BD) microscopie à fluorescence du disque oeil de type sauvage cultivée imaginale en (A) à 0, 30 et 60 points de temps minutieux révèle GFP-noyaux marqués gliales migrer à l'intérieur du disque oeil.
FH) microscopie à fluorescence du mutant oeil-cerveau complexe dans (E) à 0, 30 et 60 points de temps minutieux démontre un décrochage de la GFP-noyaux marqués gliales au sein de la tige optique (flèche). Le cerveau (BR) a été laissée attachée à la tige optiques pour faciliter l'imagerie des cellules gliales dans le pédoncule.
Figure 2: Imagerie en direct de la GFP-taggés membranes gliales dans l'œil d'un disque de type sauvage imaginale. Nous avons réussi cultivés oeil-cerveau complexes pour 240 minutes de périodes. Tissus cultivés plus de 240 minutes commence à se décomposer. Le milieu de culture entourant le disque imaginal des yeux (ED), la tige optique (OS), et le lobe du cerveau (BR) à 0 (A) et 150 minutes (B), comparativement à 300 la minute de temps-point (C), est libre de la GFP de cellules positives, indiqué par une flèche.
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Discussion
Dans ce protocole, nous décrivons l'observation de la migration des cellules gliales dans le disque imaginal des yeux en utilisant la microscopie vivre. Dans notre exemple de type sauvage (figure 1 après JC), nous avons utilisé un marqueur GFP nucléaires d'observer le mouvement des cellules gliales dans le disque les yeux au cours d'une heure. Dans un mutant d'un gène candidat requis pour la migration des cellules gliales actuellement à l'étude dans notre laboratoire, nous avons observé un décrochage de noyaux de cellules gliales au sein de la tige optique durant une période d'une heure (figure 1 EH). Notre stratégie peut être adaptée pour visualiser plus de détails sur le comportement cellulaire régulée par notre gène d'intérêt. Par exemple, une membrane cible molécule GFP, comme mCD8-GFP, peut être exprimée en cellules gliales de visualiser les processus cellulaires. Utilisation d'une membrane GFP marqueurs liés va nous permettre de déterminer si les cellules gliales dans nos mutants sont capables d'étendre les processus cellulaires tels que filopodes dans le disque oculaire. De même actine marqués à la GFP ou de la tubuline marqués à la GFP pourrait être exprimée dans les cellules gliales en développement pour visualiser les changements dans le cytosquelette lors de la migration des cellules gliales. En outre, l'examen de la GFP seule mutant marqué les cellules gliales peuvent être visualisées en utilisant la microscopie direct (6). Cette technique va nous permettre de décrire plus précisément l'exigence de notre gène d'intérêt dans la régulation de la migration des cellules gliales.
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Acknowledgments
Patrick Cafferty est soutenu par une bourse de recherche postdoctorale de la Société canadienne de la sclérose.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly-L-lysine | Reagent | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| Schneider’s Insect Media | Reagent | Sigma-Aldrich | S0146 | |
| Penicillin-Streptomycin | Reagent | Sigma-Aldrich | P4458 | |
| Insulin solution from bovine pancreas | Reagent | Sigma-Aldrich | I0516 | |
| Chamlide Magnetic chamber | Tool | Live cell Instrument | CM-R-10 | 35 mm dish type chamber for 18 mm coverslip |
| Ultra fine clipper scissors | Tool | Fine Science Tools | 15200-00 | |
| Dumont #5 forceps | Tool | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Fluorescent microscope | Microscope | Carl Zeiss, Inc. | Any fluorescent imaging system that has the necessary filters and excitation for GFP can be used. |
References
- Aigouy, B., Lepelletier, L., Giangrande, A. Glial chain migration requires pioneer cells. J. Neurosci. 28, 11635-11641 (2008).
- Silies, M., Yuva, Y., Engelen, D., Aho, A., Stork, T., Klambt, C. Glial cell migration in the eye disc. J. Neurosci. 27, 13130-13139 (2007).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
- Sepp, K. J., Auld, V. J. Conversion of lacZ enhancer trap lines to GAL4 lines using targeted transposition in Drosophila melanogaster. Genetics. 151, 1093-1101 (1999).
- Gibson, M. C., Patel, A. B., Nagpal, R., Perrimon, N. The emergence of geometric order in proliferating metazoan epitheia. Nature. 442, 1038-1041 (2006).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development. Trends Neurosci. 24, 251-254 (2001).
