Summary
Här beskriver vi ett protokoll för att undersöka migration av gliaceller i utvecklingsländerna Drosophila ögat använder levande mikroskopisk analys paras ihop med GFP taggade gliaceller.
Abstract
Gliaceller av både ryggradsdjur och ryggradslösa organismer måste migrera till slutmålet på regioner i syfte att ensheath och stöd i samband nervceller. Även om de senaste framstegen har gjorts för att beskriva den levande migration av gliaceller i utvecklingsländerna PUPP-vingen (1), studier av
Protocol
Del 1: Pre-experimentella uppsättning.
- En vecka i förväg, flugor kompis att generera larv som uttrycker GFP under kontroll av en gliaceller-specifika promotorn. För vårt experiment vi visualiseras GFP märkta med en nukleär lokalisering sekvens som uttrycks i gliaceller med omvänd polaritet (repa) promotor (3, 4).
- Förbered täckglas minst en dag i förväg genom att blötlägga 18 mm slinker runda locket i 10 minuter i 1% poly-L-lysin lösning och luft torka över natten.
- På dagen före försöket, rengöra en Chamlide magnetiska kultur kammare genom att blötlägga komponenter över natten i 70% etanol.
- På dagen för experimentet, förbereda odlingsmedium genom att lägga till fetalt bovinserum, penicillin-streptomycin lösning, och insulin till 10 ml av Schneiders insekt medel med aseptisk teknik. Arbetsgruppen koncentrationer är: 1X fetalt bovinserum, 100U/ml penicillin, 0.1mg/ml streptomycin och 0,2 mg / ml insulin i Schneiders insekt medium (modifierad från (5)).
- Låt kulturen kammaren lufttorka i en cellkultur huva. Tvätta bort kvarvarande etanol från kulturen kammaren genom att skölja med förberedda odlingsmedium.
Del 2: dissekering av Drosophila öga-hjärna komplex.
- Välj en tredje INSTAR vandrar larven från sidan av en fluga flaskan och häll i en droppe kylda kulturens medium på en petriskål på is i flera minuter. Chilling larven rekommenderas att sakta peristaltiska kroppen sammandragningar för enkel dissekering.
- Placera kylda larv i en droppe kultur medium på ett Sylgard belagd fat under en dissektion mikroskop.
- Enligt dissektion mikroskop, använda ett par Dumont fin pincett för att fatta ett fast tag larven ungefär en tredjedel av vägen från den bakre änden. Vänta tills larven extruderar munnen krokar från framändan. Ta tag i munnen krokar med en andra pincett vid full utbyggnad. Att dissekera larven, sakta dra två par tång i motsatt riktning. Det öga-hjärna komplex, tillsammans med spottkörtlar, feta kroppar och imaginal vävnad, kommer att dra bort från larver kroppen. Dra inte i munnen krokar för snabbt annars kommer de att slita av öga-hjärna komplex.
- Klippa bort spottkörtlar, feta kroppar och imaginal skivor med ultrafina klippare sax. De två hjärnhalvorna och öga-skivor kommer att knytas till den ventrala nerv sladden och krokar munnen.
- Placera en 18 slip mm locket på en glasplatta. Lämna en kant på locket glider hänger utanför kanten på bilden för att senare plocka upp locket halka. Tillsätt en droppe odlingsmedium på 18 mm täckglas. Överför öga-hjärna komplex i kulturen medium genom att ta tag i munnen krokar med tång. Ta inte tag i öga-hjärna komplex direkt med pincett eller vävnad kommer att skadas.
- Använda fina dissektion sax, klippa bort munnen krokar från öga-hjärna komplex och kasta. Borttagning av munnen krokar är viktigt för Bildproduktion som munnen krokar kommer att fortsätta att ingå avtal i odlingsmediet orsakar vävnaden att röra vid mikroskopi.
- Att visualisera gliaceller migration i ögat imaginal skivan försiktigt skära synnerven stjälken, den tunna vävnaden som förbinder hjärnan och ögat skivan och skjuta bort eller kasta hjärnan (se figur 1A). För att visualisera Glia inom optisk stjälk, lämna hjärnan, optisk stjälk, och öga imaginal skiva intakt (se figur 1E).
- Plocka upp täckglas med pincett och rita en cirkel under hela vävnaden av intresse med en permanent märkpenna. Denna cirkel kommer att hjälpa att hitta den vävnad för mikroskopi i del 4.
Del 3: Montering ögat imaginal skivan i en magnetisk kultur kammare.
- Använd pincett, ta tag i hängande kanten av täckglas. Överför täckglas till bottenplatta Chamlide magnetisk kammare utan att störa vävnaden i kulturen.
- Placera silikon O-ringen på huvuddelen av Chamlide kammaren. Installera huvuddelen ovanpå bottenplattan.
- Tillsätt långsamt odlingsmedium till kammaren. Lägg inte till odlingsmediet för snabbt eller i vävnaden av intresse blir störd. Inte helt fylla i kammaren för att för gasutbyte under locket.
- Placera försiktigt osynliga locket på toppen av Chamlide kammaren.
Del 4: Visualisering av flyttande gliaceller i ögat skivan.
- Placera kultur kammare på scenen av en konfokala eller fluorescensmikroskop. Leta rätt på provet med hjälp av cirkel på täckglas som referens på låg förstoring.
- Fokus på provet med en 40x lins. Låt vävnaden att lösa på täckglas. Ta bilder av ögat skivan eller optisk stjälk varje 10-15min under 3-4 timmar. Vävnaden kan rycka och flytta ut ur fokus. Manuellt fokus vävnaden innan bildfångst kommer att minska thär problemet.
Del 5: representativa resultat:
Utförs korrekt, får våra protokoll för oss att samla in en serie bilder av GFP-märkta gliaceller som migrerat från synnerven stjälken i ögat imaginal skivan (figur 1 BD). Samtidigt lever bildhantering för en 60-minuters period räckte för att observera förändringar i positionerna av stödjeceller kärnor inom en vild typ öga imaginal skiva, gliaceller kärnor i en mutant av en gen som behövs för gliacellsmarkörer migration misslyckats totalt för att avsluta optisk stjälk (pilar Figur 1 FH).
Vi har odlade öga-hjärna komplex för perioder så länge som 240 minuter innan observera försämring av den odlade vävnaden. Efter 240 minuters tid-punkt vi börja följa GFP positiva celler i odlingsmediet omgivande odlade öga-hjärna komplex (pil Figur 2 C). Dessutom GFP kommer att samlas i diffusa fläckar i hela vävnader tyder på en uppdelning i vävnad integritet.
Figur 1: Live avbildning av GFP-märkta gliaceller kärnor i utvecklingsländerna vildtyp och mutant visuella system.
A, E) Bilder tagna med kontrast differential interferens (DIC) mikroskopi av odlade vildtyp och mutant öga imaginal skivor (ED). I den vilda typen, är gliaceller född och migrera från synnerven stjälk (OS) i ögat-skiva. Hjärnan har tagits bort för att underlätta plattas och avbildning i ögat imaginal skivan. BD) fluorescensmikroskopi av vildtyp odlade öga imaginal skiva i (A) vid 0, avslöjar 30 och 60 minuter tidpunkter GFP-märkta gliaceller kärnor vandrar i ögat skivan.
FH) fluorescensmikroskopi av den muterade öga-hjärna komplex i (E) på 0, visar 30 och 60 minuter tidpunkter en blockering av GFP taggade-gliaceller kärnor inom optisk stjälk (pil). Hjärnan (BR) har lämnat fäst vid synnerven stjälken för att underlätta avbildning av Glia i stjälken.
Figur 2: Live avbildning av GFP-märkta gliaceller membran i en vild typ öga imaginal skiva. Vi har framgångsrikt odlade öga-hjärna komplex för 240-minuters perioder. Tissue odlade längre än 240 minuter börjar att bryta ner. Odlingsmediet kring ögat imaginal skivan (ED), optisk stjälk (OS), och hjärnan lob (BR) på 0 (A) och 150 minuter (B), jämfört med 300 minuter tid-punkt (C), är fri av GFP-positiva celler, vilket indikeras av en pil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I detta protokoll beskriver vi observation av gliacellsmarkörer migration i ögat imaginal skiva med live-mikroskopi. I vårt vild typ exempel (figur 1 AD), använde vi en nukleär GFP markör för att följa gliacellsmarkörer rörelse i ögat skivan under loppet av en timme. I en mutant för en kandidat gen som krävs för gliacellsmarkörer migration närvarande utreder i vårt laboratorium, observerade vi en blockering av stödjeceller cellkärnor inom optisk stjälk under en timmes tid (figur 1 EH). Vår strategi kan anpassas för att visualisera närmare av cellulära beteende regleras av våra gener av intresse. Till exempel, ett membran riktad GFP molekyl, såsom mCD8-GFP, kan uttryckas på Glia att visualisera cellulära processer. Användning av membranbundna GFP markör ger oss möjlighet att avgöra om gliaceller i vår mutanter kan utvidga cellulära processer såsom filopodia i ögat skivan. Likaså aktin taggade med GFP eller tubulin taggade med GFP kan uttryckas i utvecklingsländerna Glia att visualisera förändringar i cytoskelettet under gliacellsmarkörer migration. Dessutom kan en undersökning av enstaka GFP-märkta mutant gliaceller åskådliggöras med hjälp av live-mikroskopi (6). Denna teknik kommer att tillåta oss att mer exakt beskriva krav på våra gener av intresse att reglera invandringen av gliaceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Patrick Cafferty stöds av ett postdoktorsstipendium från Multiple Sclerosis Society of Canada.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly-L-lysine | Reagent | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| Schneider’s Insect Media | Reagent | Sigma-Aldrich | S0146 | |
| Penicillin-Streptomycin | Reagent | Sigma-Aldrich | P4458 | |
| Insulin solution from bovine pancreas | Reagent | Sigma-Aldrich | I0516 | |
| Chamlide Magnetic chamber | Tool | Live cell Instrument | CM-R-10 | 35 mm dish type chamber for 18 mm coverslip |
| Ultra fine clipper scissors | Tool | Fine Science Tools | 15200-00 | |
| Dumont #5 forceps | Tool | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Fluorescent microscope | Microscope | Carl Zeiss, Inc. | Any fluorescent imaging system that has the necessary filters and excitation for GFP can be used. |
References
- Aigouy, B., Lepelletier, L., Giangrande, A. Glial chain migration requires pioneer cells. J. Neurosci. 28, 11635-11641 (2008).
- Silies, M., Yuva, Y., Engelen, D., Aho, A., Stork, T., Klambt, C. Glial cell migration in the eye disc. J. Neurosci. 27, 13130-13139 (2007).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
- Sepp, K. J., Auld, V. J. Conversion of lacZ enhancer trap lines to GAL4 lines using targeted transposition in Drosophila melanogaster. Genetics. 151, 1093-1101 (1999).
- Gibson, M. C., Patel, A. B., Nagpal, R., Perrimon, N. The emergence of geometric order in proliferating metazoan epitheia. Nature. 442, 1038-1041 (2006).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development. Trends Neurosci. 24, 251-254 (2001).
