Summary
Здесь мы опишем протокол для изучения миграции глиальных клеток в развивающихся дрозофилы глаз с использованием живых микроскопического анализа в паре с меткой GFP глиальных клеток.
Abstract
Глиальных клеток обеих позвоночных и беспозвоночных организмов должны перейти на заключительный целевых регионов для того, чтобы ensheath и поддержки связанных нейронов. Хотя в последнее время прогресс был достигнут, чтобы описать живую миграцию глиальных клеток в развивающемся куколки крыло (1), исследования
Protocol
Часть 1: Pre-экспериментальной установки.
- Один неделю вперед, приятель мухи генерировать личинки, которые выражают GFP под контролем глиальных конкретных промоутера. Для нашего эксперимента мы визуализировали GFP с меткой ядерное последовательность локализации выраженных в глиальных клеток с использованием обратной полярности (РЕПО) промоутер (3, 4).
- Подготовка крышка скользит по крайней мере один день, впитывая 18 мм скользит круглой крышкой в течение 10 минут в 1% поли-L-лизин раствора и сухой воздух в одночасье.
- За день до эксперимента, чистый Chamlide магнитной камеры культуры, впитывая компонентов на ночь в 70% этанола.
- В день эксперимента, подготовить культуральной среде, добавив эмбриональной телячьей сыворотки, пенициллин стрептомицин решение, и инсулина до 10 мл насекомых среды Шнайдера использованием асептических условиях. Рабочая концентрация: 1X эмбриональной телячьей сыворотки; 100U/ml пенициллина; 0.1mg/ml стрептомицин, и 0,2 мг / мл инсулина в насекомое среду Шнайдера (с изменениями от (5)).
- Разрешить культуры камеры высохнуть на воздухе в капот культуре клеток. Смыть остаточного этанола из культуры камере промывки Готовую среду культуры.
Часть 2: Препарирование дрозофилы глаз-мозг комплекса.
- Выбор третьего возраста блуждающих личинки со стороны флакона летать и место в капле охлажденной культуральной среды на чашку Петри на льду в течение нескольких минут. Охлаждение личинки рекомендуется медленное перистальтических сокращений тела для удобства вскрытия.
- Место охлажденной личинки в капле питательной среды на Sylgard покрытием блюдо под рассечение микроскопом.
- Под микроскопом рассечение, используйте пару Дюмон штраф щипцы твердо усвоить личинки примерно треть пути от заднего конца. Подождите, пока личинка выдавливает его крючки рта от переднего конца. Возьмитесь рот крючки с второй парой щипцов при полном разгибании. Чтобы вскрыть личинка, медленно вытяните две пары щипцов в противоположных направлениях. Глаз-мозг комплекса, а также слюнные железы, жир тела, и имагинальные ткани, будет тянуть в сторону от тела личинки. Не тяните рот крючки слишком быстро, иначе они будут отрывать от глаз-мозг комплекса.
- Trim от слюнных желез, жира тела, и имагинальные диски, используя ультра-тонкой ножницы клипер. Двух полушарий мозга и глаз-диски будут прикреплены к брюшной нервной и рот крючков.
- Место 18 мм покрытие скольжения на предметное стекло. Оставьте один край покровным стеклом висит у края слайда, чтобы позже забрать покровным стеклом. Добавить каплю питательной среды на 18 скольжению покрытие мм. Передача глаз-мозг комплекса в культуральной среде, держа рот крючка щипцами. Не понять глаз-мозг комплекса непосредственно с пинцетом или ткани будет поврежден.
- Использование тонких ножниц вскрытия, обрезать рот крючки из глаз-мозг комплекса и выбросьте. Удаление рот крючки важно для живого изображения, как рот крючки будут продолжать сокращаться в культуральной среде, вызывая ткани для перемещения во время микроскопии.
- Для визуализации глиальных миграции внутри глаза имагинальных дисков, тщательно вырезать глазного стебля, тонкие ткани, которая соединяет мозг и глаза диска и отталкивать или отказаться от головного мозга (см. рисунок 1А). Для визуализации глии в глазной стебель, оставьте мозга, глазного стебля, а глаза имагинальных дисков без изменений (см. рис 1E).
- Возьмите покровное использованием щипцов и нарисуйте круг вокруг под тканью, с перманентным маркером. Этот круг будет помогать в поиске ткани для микроскопии в части 4.
Часть 3: Монтаж глаз имагинальных дисков в магнитном камере культуры.
- Использование щипцов, держитесь висит краю покровного стекла. Передача покровное к нижней пластине Chamlide магнитной камеры, не нарушая ткани в культуре.
- Место силиконовые уплотнительные кольца на корпусе камеры Chamlide. Установите основной части в верхней части нижней панели.
- Медленно добавляйте питательной среды для камеры. Не добавляйте в культуральной среде, слишком быстро или тканью, будет нарушен. Не полностью заполнить камеру для обеспечения газообмена под крышкой.
- Аккуратно невидимой крышкой на верхней части камеры Chamlide.
Часть 4: Визуализация мигрирующих глиальных клеток в глазу диска.
- Место культуры камеру на сцене конфокальной или флуоресцентного микроскопа. Найдите примера с использованием круга на покровное как ссылка на малом увеличении.
- Сосредоточьтесь на образец с помощью 40x объектива. Разрешить ткани оседают на покровное. Захват изображений на диске глаза или глазной стебель через каждые 10-15мин в течение 3-4 часов. Ткань может дергаться и двигаться не в фокусе. Ручная фокусировка ткани до захвата изображения снимет йявляется проблемой.
Часть 5: Представитель результаты:
Выполнены правильно, наш протокол позволил нам собрать серию изображений GFP с метками глиальных клеток, которые мигрировали из глазного стебля в глаз имагинальных дисков (рис. 1 BD). Хотя жить изображений для 60-минутного периода, было достаточно, чтобы наблюдать за изменениями в позициях глиальных ядер внутри дикого типа глаз имагинальных дисков, глиальных ядер в мутанта для гена необходимые для миграции клеток глии совершенно не выход глазного стебля (стрелки Рисунок 1 FH).
У нас есть культурный глаз-мозг комплексов на период до тех пор, как 240 минут до наблюдения ухудшение культурного ткани. После 240-минутный временной точке мы начинаем наблюдать GFP-положительных клеток в культуральной среде окружающего культурного глаз-мозг комплексов (стрелка Рисунок 2 C). Кроме того GFP будет накапливаться в расплывчатых пятен по всему тканей предположить нарушение целостности тканей.
Рисунок 1: Live изображений GFP с метками глиальных ядер в развивающихся дикого типа и мутантных визуальных систем.
, Е) Изображения, полученные с помощью дифференциальных интерференционного контраста (DIC) микроскопии культурного дикого типа и мутантных глаз имагинальных дисков (ЭД). В дикого типа, глиальные клетки рождаются в и мигрируют из глазного стебля (ОС) в глаз-диска. Мозга была удалена, чтобы облегчить выравнивание и визуализации глаз имагинальных дисков. BD) Флуоресцентная микроскопия дикого типа культурный глаз имагинальных дисков в (А) при 0, 30 и 60 минут моменты времени показывает, GFP с метками глиальных ядра мигрируют внутри глаза диска.
FH) Флуоресцентная микроскопия мутантного глаз-мозг комплекса в (E) при 0, 30 и 60 минут моменты времени демонстрирует пробуксовки GFP с метками глиальных ядер внутри глазной стебель (стрелка). Мозга (БР) был оставлен прилагается к глазной стебель для облегчения визуализации глии в стебле.
Рисунок 2: Живая съемка GFP с метками глиальных мембран в дикого типа глаз имагинальных дисков. Мы успешно культурный глаз-мозг комплексов для 240-минутных периодов. Ткань культурные дольше, чем 240 минут начинает разрушаться. Культуральной среде окружающих глаз имагинальных дисков (ЭД), глазного стебля (ОС), и мозг доли (БР) на 0 () и 150 минут (В), по сравнению с 300 минуты временной точке (С), свободна из GFP-положительных клеток, указывает стрелка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этом протоколе описываются наблюдения миграции клеток глии в глаз имагинальных дисков с использованием живых микроскопии. В нашем примере дикого типа (рис. 1 г. н.э.), мы использовали ядерное маркера GFP наблюдать глиальных движения ячейки в глазу диск в течение одного часа. В мутанта для генов-кандидатов, необходимые для миграции клеток глии в настоящее время изучается в нашей лаборатории, мы наблюдали срыва глиальных клеточных ядер в пределах глазной стебель течение одного часа (рис. 1 ГБ). Наша стратегия может быть адаптирована к себе более подробно клеточных поведение регулируется нашими гена. Например, мембраны целевых GFP молекулы, такие как mCD8-GFP, может быть выражена в глии для визуализации клеточных процессов. Использование мембраносвязанных маркера GFP позволит нам определить, если глиальных клеток в нашем мутанты способны расширения клеточных процессов, таких как филоподий в глаз диска. Аналогично актина с меткой GFP или тубулина с меткой GFP может быть выражена в развивающихся глии для визуализации изменения цитоскелета во время миграции клеток глии. Кроме того, рассмотрение одного GFP меченных мутантов глиальные клетки могут быть визуализированы с использованием живых микроскопии (6). Эта техника позволит нам более точно описать требования для наших интересующего гена в регулировании миграции глиальных клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Патрик Кафферти поддерживается докторской стипендий, начиная с нескольких общества рассеянного склероза Канады.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly-L-lysine | Reagent | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| Schneider’s Insect Media | Reagent | Sigma-Aldrich | S0146 | |
| Penicillin-Streptomycin | Reagent | Sigma-Aldrich | P4458 | |
| Insulin solution from bovine pancreas | Reagent | Sigma-Aldrich | I0516 | |
| Chamlide Magnetic chamber | Tool | Live cell Instrument | CM-R-10 | 35 mm dish type chamber for 18 mm coverslip |
| Ultra fine clipper scissors | Tool | Fine Science Tools | 15200-00 | |
| Dumont #5 forceps | Tool | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Fluorescent microscope | Microscope | Carl Zeiss, Inc. | Any fluorescent imaging system that has the necessary filters and excitation for GFP can be used. |
References
- Aigouy, B., Lepelletier, L., Giangrande, A. Glial chain migration requires pioneer cells. J. Neurosci. 28, 11635-11641 (2008).
- Silies, M., Yuva, Y., Engelen, D., Aho, A., Stork, T., Klambt, C. Glial cell migration in the eye disc. J. Neurosci. 27, 13130-13139 (2007).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
- Sepp, K. J., Auld, V. J. Conversion of lacZ enhancer trap lines to GAL4 lines using targeted transposition in Drosophila melanogaster. Genetics. 151, 1093-1101 (1999).
- Gibson, M. C., Patel, A. B., Nagpal, R., Perrimon, N. The emergence of geometric order in proliferating metazoan epitheia. Nature. 442, 1038-1041 (2006).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development. Trends Neurosci. 24, 251-254 (2001).
